[0074] 2.3基于馬鈴馨基因組區(qū)段特異標(biāo)記開發(fā)
[0075] 根據(jù)上述兩類標(biāo)記，對上述群體親本和單株進(jìn)行擴增，構(gòu)建初步遺傳圖譜，進(jìn)行初 步定位。根據(jù)初步定位結(jié)果，參考已測序的馬鈴馨基因組序列，在定位的區(qū)段內(nèi)設(shè)計相應(yīng)的 引物，通過測序找出差異片段設(shè)計引物，用于檢測群體后代中該基因的差異。
[0076] PCR擴增體系（2化1)如下：DNA模板（SOngAil)化1，上下引物（IOiiM)各0.扣1，化aq PCR Mix(2X)10山，d地2〇祉IJCR反應(yīng)程序也采用Touchdown PCR程序：95°C預(yù)變性3min， 然后12循環(huán)依次經(jīng)過95°C變性lmin、Ta°C (每循環(huán)減少0.5°〇1111111、72°(：延伸11111113〇3，隨后 23循環(huán)依次經(jīng)過95°C變性lmin、Ta-6°C退火lmin、72°C延伸lmin30s，最后72°C延伸5min。其 中CAPS標(biāo)記酶切所用的酶包括AluI、A化I和化ql，均由化kara公司提供，酶切體系如表7所 /J、- O
[0077] 表7酶切體系
[007引
[0079] 擴增產(chǎn)物檢測流程同AFLP。
[0080] 3、遺傳圖譜構(gòu)建
[0081] SS財示記和特異區(qū)段標(biāo)記讀帶是先用相機對聚丙締酷胺凝膠電泳后的膠片進(jìn)行拍 照，利用照片進(jìn)行讀帶，首先按照點樣順序逐條對多態(tài)性條帶進(jìn)行多態(tài)性比對，有差異的條 帶出現(xiàn)記為1，不出現(xiàn)記為0,不易辨認(rèn)或缺失的記為"-";AFLP的帶型記錄是將銀染后的膠 板放置在白光燈箱上直接讀帶，方法同SSR。利用Quan 1 ity one(Bio-rad，USA)計算擴增片 段的分子量大小。將所有帶型錄入Excel,并對多態(tài)性位點進(jìn)行命名，命名原則是引物名稱 加上擴增片段大小，如S012_230表示SSR引物S012擴增的大小為23化P的多態(tài)性位點。
[0082] 連鎖圖譜的構(gòu)建使用計算機軟件化inmap 4(化n Ooijen 2006)，將所有分子標(biāo)記 的帶型按照該軟件要求進(jìn)行轉(zhuǎn)換后導(dǎo)入軟件，采用雙擬測交策略（Grattapaglia and Sederoff 1994)，構(gòu)建雙親的圖譜化和B)。連鎖群的劃分采用independence LOD值，Stad 值設(shè)置為2.0，end值設(shè)置為10.0、St邱值設(shè)置為1.0，劃分連鎖群時LOD闊值為3.0。計算遺傳 距離的函數(shù)為Kosambi函數(shù)。連鎖群的編號和方向是根據(jù)已報道的SSR標(biāo)記W及候選基因標(biāo) 記的遺傳定位信息來確定的，編號后加上B表示為父本5.66的]1曰1111:;[;[的連鎖群，6表示為母 本邸25的連鎖群。
[0083] 4、表型鑒定
[0084] EB群體的田間種植在由不同年份和不同地點組合而成的6個不同環(huán)境下進(jìn)行， 2008年種植了S個地點，分別是長嶺崗（109.8E，30.2N)、天池山（109.7E，30.3N)和武漢 (114.4E，30.5N) ,2010年的種植點為武漢，2012年分別在天水（105.6E，34.6N)和武漢種植， 田間試驗設(shè)計采用順序排列法，每個基因型3個重復(fù)，每重復(fù)種植10株。
[0085] 在收獲后的塊莖中選取無病蟲害、較大的馨塊9-15個，室溫放置7天后分別進(jìn)行如 下3個處理后：1)測定塊莖中的還原糖含量，即收獲后還原糖含量(Od) ;2)將馨塊4°C膽藏 30d后測定塊莖中還原糖含量，即低溫糖化后還原糖含量(4°C30d);3)將低溫處理30d后的 馨塊，轉(zhuǎn)入室溫放置20d后測定還原糖含量，即回暖后還原糖含量。邸群體田間實驗設(shè)計和 塊莖處理方式如表8所示。
[00化]表8邸群體田間實驗設(shè)計和塊莖處理方式
[0087]
[0088] a"-"數(shù)據(jù)缺失;b4°C30d，低溫膽藏30d;c Rec，室溫回暖20d。
[0089] 還原糖含量的測定方法如下：
[0090] 用打孔器取馨塊的不同部位，并將其切成薄片后稱重，然后用真空凍干機動凍干 后稱干重，計算干鮮重比。稱取凍干后的干粉約15mg與1.5ml離屯、管中，加入80%酒精提取 液lml，80°C水浴60分鐘，13000r/min離屯、9min后將上清液倒入另一 1.5ml離屯、管，將含有上 清液的離屯、管放在80°C恒溫干浴器中，將酒精蒸發(fā)掉，待酒精蒸發(fā)完后加20化1蒸饋水，搖 勻后放入55°C烘箱30min充分溶解還原糖，然后取樣品溶液于PCR板，加入事先配好的 DNS溶液離屯、PCR板至充分下沉，然后將PCR板蓋上蓋子后置于95 °C干浴器上加熱5min， 反應(yīng)完成后立即用冰快速冷卻，再加蒸饋水16化1，混勻后取10化1至酶標(biāo)板用全自動酶標(biāo) 儀化LxSOOO)測定540nm波長下的吸光值。用不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(0-5mg/ml)，與樣品 相同的反應(yīng)體系做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中還原糖的濃度。
[0091] 5、低溫糖化相關(guān)性狀的OTL定位和位點間的互作分析
[0092] QTLs定位軟件義用的是MapQ^ 6(化n Ooi jen 2009)，首先通過F*e;rmu1:ationTest (1000次迭代)來估計不同環(huán)境和處理組合在a = 0.05水平上的LOD闊值，然后使用區(qū)間作圖 法（IM)找到確定的QTLs和與其緊密連鎖的標(biāo)記，W緊密連鎖的標(biāo)記為Cofactor用于多模型 作圖(mutiple Q化model，MQM)檢測。IM和MQM均WlcM的步長掃描整個基因組，W連鎖群上 LOD值最大的位置作為WL的位置。Q化的名稱由CIS和親本名化D或者Sb) W及染色體號組 成，同一染色體上不同的OTL用阿拉伯?dāng)?shù)字加 W區(qū)分。如果2個WL的2-L0D置信區(qū)間重疊，貝U 被視為一個QTL。連鎖圖譜和OTL的位置用MapChart 2.2(Voorrips2002)繪制。
[0093] 采用軟件OTL化twork v2.2(化ng et al2007)結(jié)合表型對標(biāo)記進(jìn)行加性和上位性 互作分析。將邸群體中相斥連鎖相的標(biāo)記參照化islain et al(2001)中方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn) 換后按照回交群體進(jìn)行分析，軟件參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。上位性位點命名方式與用MapQTL 6 定位出的OTL的命名相似，只是在CIS后加上了I表示上位性QTL。
[0094] 然后分別進(jìn)行QTL定位和加性效應(yīng)位點的分析。共檢測到4個具有加性效應(yīng)的QTL， 分別是ClSSbOS-UQll的表示方法為性狀名CI巧日連鎖圖編號Sb05加阿拉伯?dāng)?shù)字，其中Sb05 表示為父本5號染色體，阿拉伯?dāng)?shù)字為該染色體上WL的編號）、CISED06-l、CISED06-3和 CISED07-1，其對應(yīng)的引物編號分別為S3002、S3001、S3003和S3004，具體如圖2所示。
[00巧]實施例2
[0096] 對實施例1中篩選得到的4個分子標(biāo)記進(jìn)行驗證
[0097] 本發(fā)明測定EB群體在3個不同環(huán)境（長嶺崗（109.8E，30.2N)、天池山（109.7E， 30.3N)和武漢al4.4E，30.5N))中種植后塊莖經(jīng)過低溫膽藏后(4°C30d)的還原糖含量，還 原糖含量測定方法同實施例1;田間試驗設(shè)計采用順序排列法，每個基因型3個重復(fù)，每重復(fù) 種植10株。
[0098] 邸群體的嫩葉采用改良CTAB法提取基因組，具體步驟同實施例1。
[0099] 經(jīng)檢測，提取的基因組含量為50-200ngAU，然后分別WS3001-S3004核酸序列的 引物對進(jìn)行降落PCR。
[0100] 各分子標(biāo)記的降落PCR體系均為，具體如下:超純水(d地2〇)1化1，自然群體的 基因組DNA化iaOXBuffer化1，濃度為IOmM的dNTPs 0.化1，濃度為IOiiM的上游引物0.化 1，濃度為1 OyM的下游引物0.化1，I^qDNA聚合酶0.化1。
[0101] 降落PCR擴增程序均為：95°C預(yù)變性3min;94°C變性3〇3,58°(：退火3〇3,72°(：延伸 Imin,循環(huán)11次，每次循環(huán)退火溫度降0.5°C;94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，循 環(huán)33次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0102] 分子標(biāo)記為S3003，PCR擴增產(chǎn)物先采用Alu I酶酶切，酶切體系如下:擴增反應(yīng)產(chǎn) 物IOiU,濃度為IUAU的Alu I酶0.扣1，10 XLBO.化1，超純水(d地20)9.4山，37°C酶切化，保 存4 °C至取出進(jìn)行檢測；
[0103] 分子標(biāo)記為S3004，PCR擴增產(chǎn)物先采用Afa I酶酶切，酶切體系如下:擴增反應(yīng)產(chǎn) 物IOiU，濃度為IUAU的Afa I酶0.扣1，10 X LBO.化1，0.1 %B