檢測(cè)采用6% ±0.5%非變性聚丙締酷胺凝膠電泳進(jìn)行，然后進(jìn)行銀 染，觀察結(jié)果即可。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0027] (1)本發(fā)明提供的馬鈴馨低溫糖化抗性的分子標(biāo)記組合，該分子標(biāo)記組合對(duì)馬鈴 馨低溫糖化抗性靈敏度高，準(zhǔn)確性好，為馬鈴馨低溫糖化抗性的鑒定提供基礎(chǔ)。
[0028] (2)本發(fā)明還提供了馬鈴馨低溫糖化抗性的分子標(biāo)記的篩選方法，通過(guò)對(duì)不同種 系不同低溫糖化抗性的品種用親本和高代系進(jìn)行候選基因標(biāo)記多態(tài)性分析；同時(shí)，對(duì)低溫 糖化抗性進(jìn)行鑒定，進(jìn)行標(biāo)記和低溫糖化抗性之間的相關(guān)性分析，篩選得到用于建立加工 品質(zhì)育種分子標(biāo)記輔助選擇體系的分子標(biāo)記組合。
[0029] (3)本發(fā)明提供的一種馬鈴馨低溫糖化抗性的檢測(cè)方法，采用特定的降落PCR擴(kuò)增 的體系W及程序，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，無(wú)明顯的雜帶出現(xiàn)，擴(kuò)增得到的片段易于檢測(cè)；分子標(biāo)記 為S3003和S3004時(shí)，兩者PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物沒(méi)有多態(tài)性，因此，酶切后才能觀察到其多態(tài) 性，W實(shí)現(xiàn)鑒定的目的；最終通過(guò)觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的狀況判斷馬鈴馨的低溫糖化抗性，方 便易行，為馬鈴馨低溫糖化分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，W下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0031] 圖巧本發(fā)明實(shí)施例1中邸群體的來(lái)源雜交圖譜；
[0032] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中篩選得到的4個(gè)具有加性效應(yīng)的QTL的定位圖譜；
[0033] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中加性效應(yīng)OTL與邸群體還原糖含量關(guān)系的柱形圖；
[0034] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中加性效應(yīng)WL與其他馬鈴馨群體還原糖含量關(guān)系的柱形 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過(guò)市售獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 1、材料：W二倍體馬鈴馨Fl群體化B群體)作為材料，邸群體是由母本抓25和父本 CW2-1雜交產(chǎn)生的178個(gè)后代，具體見(jiàn)圖1所示。其中ED25含有2個(gè)栽培種S.phureja、 8.1：116日1'〇3111]1和1個(gè)野生種5.￥日1']1日;[的血緣，不抗低溫糖化；〔￥2-1是馬鈴馨野生種 S. berthaulti i的一個(gè)無(wú)性系，抗低溫糖化。
[0038] 邸群體表型鑒定結(jié)果表明，低溫膽藏后和回暖后后代間還原糖含量存在明顯的分 離，呈正態(tài)分布，適合用于OTL定位分析。
[0039] 2、分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法
[0040] 2. IAFLP標(biāo)記
[0041] 1)基因組DNA的提取
[0042] 分別對(duì)邸群體的嫩葉采用改良CTAB法提取基因組，具體步驟如下：
[0043] 取幼嫩葉片300mg，加入1000 iil CTAB抽提緩沖液(預(yù)熱至95°C )和少量石英砂，磨 樣機(jī)研磨；
[0044] 65°C水浴化后自然冷卻至室溫；
[0045] 12000;r/min離屯、15min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離屯、管中；
[0046] 加入等體積25:24:1 (除色素和蛋白），緩慢搖動(dòng)至上清發(fā)白；
[0047] 1200化/min離屯、15min，取上清，用24:1抽提一次（除去殘留的酪），操作步驟重復(fù) 3-5,取上清后注入到已加好等體積異丙醇(預(yù)冷)和1/10體積的3M醋酸鋼的新的2ml離屯、管 中（沉淀DNA);
[004引 -20°C放置化(充分沉淀DNA后倒去上清，用75%的乙醇泡洗兩次。自然驚干后用50 y 1無(wú)菌水溶解DNA，加入5%體積的RNA酶（lOmg/ml)，置于55°C烘箱40min(消化RNA);
[0049] 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，無(wú)降解無(wú)蛋白質(zhì)和RNA的用作分子標(biāo)記擴(kuò)增 的模板。
[0050] 2)引物擴(kuò)增
[005。 AFLP標(biāo)記檢測(cè)分析流程參照Vos et al.( 1995)，共用了 37對(duì)引物組合，由7個(gè) EcoRI 引物（核屯、序列5 '-GACTGCGTACC AATTC-3 ' 加選擇性堿基AAA、AAC、ACA、AGA、ATG、ACT 和AGT)和6個(gè)MseI引物（核屯、序列5 ' -GATGAGTCCTGAGTAA-3 '加選擇性堿基ACG、CAC、CAG、 CAT、CGT和CTA)組合而成。按表1首先對(duì)提取的基因組進(jìn)行酶切，37°C酶切化后68°C20min終 止酶切;然后利用接頭引物合成接頭雙鏈，表2為接頭雙鏈合成體系化adpt和Ma化t )，合成 過(guò)程為65°C10min、37°C10min、25°C10min，合成完成后冰上冷卻備用;然后就是利用已合成 的接頭雙鏈和酶切了的基因組進(jìn)行接頭和基因組片段的連接，體系見(jiàn)表3d16°C連接10h，60 "ClOmin終止反應(yīng)。接下來(lái)分別是預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)，預(yù)擴(kuò)體系見(jiàn)表4,程序?yàn)?5°C變性3min，然后 20個(gè)循環(huán)按照95°C變性30s、56°C退火30s、72°C延伸Imin進(jìn)行，最后72°C充分延伸5min。選 擴(kuò)體系見(jiàn)表5,程序?yàn)門(mén)ouchdown程序，95 °C變性3min，然后13個(gè)循環(huán)依次經(jīng)過(guò)95 °C 30s、65 °C (每循環(huán)減少0.7 °C) 30s、72 °C Imin，隨后23個(gè)循環(huán)依次經(jīng)過(guò) 95 °C 30s、56 °C 30s、72 °C Imin，最 后 72°C5min。
[0052] 表1酶切體系 [0化3] LUUOOJ 巧4了義出14^巧
[0化9] LQQ63」3)擴(kuò)増產(chǎn)物粒測(cè)
[0064]使用由北京市六一儀器廠提供的DYCZ-20C型的DNA序列分析電泳儀，用此電泳儀 將PCR產(chǎn)物電泳分離，分離膠為6%的聚丙酷胺凝膠，最后銀染檢測(cè)化an et al 2008)。 [00化]2.2基于馬鈴馨基因組的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)
[0066] 從http: //potato . plantbioIogy. msu. edu/pgsc_download. shtml上下載PGSC_ DM_v4.03基因組序列，W至少9個(gè)重復(fù)的2堿基，6個(gè)重復(fù)的3堿基或5個(gè)重復(fù)的4堿基為檢索 標(biāo)準(zhǔn)檢索并按照染色體位置順序編號(hào)。
[0067] 前期對(duì)低溫糖化性狀的初步定位分析發(fā)現(xiàn)5號(hào)和6號(hào)上均有較為穩(wěn)定的QTLs位點(diǎn)， 且運(yùn)兩條染色體上的標(biāo)記較少，圖譜密度低，因此，針對(duì)運(yùn)兩條染色體進(jìn)行了如下所述的 SSR標(biāo)價(jià)的開(kāi)發(fā)和定位。
[0068] 首先選取5號(hào)和6號(hào)染色體上重復(fù)序列長(zhǎng)度為70-800bp的序列，并根據(jù)其位于染色 體上的位置提取兩端側(cè)翼序列各5(K)bp，去除掉側(cè)翼序列是重復(fù)序列或者為N和在基因組中 多拷貝的序列，剩下的與番茄基因組比對(duì)，得到側(cè)翼序列的保守序列，根據(jù)保守序列利用 Primer premier 5.0(Sin曲et al 1998)設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)的條件是：退火溫度（Tm)為 39°C-65°C，且上下引物退火溫度不超過(guò)3°C;引物長(zhǎng)度為21±加口;6(：含量為45-55%;5'端 自由能大于3'端，3'端自由能小于9KJ/mol，結(jié)尾盡量為GC;3'端不要出現(xiàn)連續(xù)3個(gè)堿基相 連，比如GGG，CCC;盡量避免引物二聚體。共設(shè)計(jì)位于5號(hào)染色體上的SSR引物40對(duì)，位于6號(hào) 染色體上的SSR引物59對(duì)，具體如表6所示。引物設(shè)計(jì)后由上海生工工程技術(shù)有限公司合成。 除此W外，本研究還選取了204對(duì)已報(bào)道的SSR標(biāo)記(MHbourne et all998;Feingold et al 2005；Ghislain et al 2009)〇
[0069] SSR引物的多態(tài)性檢測(cè)首先在兩個(gè)親本中進(jìn)行，只有在兩親本中有多態(tài)性的引物 才用于群體后代的多態(tài)性檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系如表6所示。
[0070] 表6 SSR引物的擴(kuò)增體系
[0072] PCR反應(yīng)程序采用touchdown PCR程序:95°C預(yù)變性3min，然后12循環(huán)依次經(jīng)過(guò)95 。(:變性30s ,Tm°C (每循環(huán)減少0.5°C )30s，72°C延伸Imin;隨后23循環(huán)依次經(jīng)過(guò)95°C變性 30s、Tm-6°C 退火 3〇3,72°(：延伸1111111，最后72°(：延伸5111111。所用的？〔1?儀器為161?4016腫 (Biometra)?；癁橥嘶饻囟?，單位為。C。
[0073] 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法同AFLP。