。新合成的核酸可W與所公開內(nèi)容的多核巧酸(包含序列)在允許它們雜交的條件下接 觸。
[0043] 作為選擇并且在所公開內(nèi)容的另一個(gè)實(shí)施方式中，基因表達(dá)可W使用對(duì)細(xì)胞樣品 中的個(gè)體基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì)）的一個(gè)或者多個(gè)表位具有特異性的一種或者多種抗體分析該 樣品中的感興趣的表達(dá)蛋白來確定。運(yùn)些抗體優(yōu)選被標(biāo)記W允許它們?cè)诮Y(jié)合至基因產(chǎn)物之 后容易地進(jìn)行檢測(cè)。
[0044] 術(shù)語(yǔ)"標(biāo)簽"是指能夠生成指示所標(biāo)記的分子的存在的可檢測(cè)信號(hào)的組合物。適當(dāng) 的標(biāo)簽包括放射性同位素、核巧酸發(fā)色團(tuán)、酶、底物、巧光分子、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒、生 物發(fā)光部分W及類似的標(biāo)記等。因此，標(biāo)記是能夠通過光譜法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、免疫 化學(xué)法、電學(xué)法、光學(xué)法或者化學(xué)法檢測(cè)的任意組合物。
[0045] 術(shù)語(yǔ)"支持物"是指常規(guī)支持物例如珠子、顆粒、浸量尺、纖維、過濾器、膜和硅烷或 者娃酸鹽支持物例如載玻片等。
[0046] 本文使用的"癌癥組織樣品"或者"癌癥細(xì)胞樣品"是指從受相應(yīng)癌癥困擾的個(gè)體 分離的含細(xì)胞的組織樣品。所述樣品可W來自通過外科手術(shù)例如活檢法取下的材料。運(yùn)樣 的樣品是基礎(chǔ)分離物(不同于培養(yǎng)的細(xì)胞)并且可W通過本領(lǐng)域認(rèn)識(shí)到的任意適當(dāng)方式收 集。在一些實(shí)施方式中，"樣品"可W通過非介入性方法包括但不限于磨蝕(abrasion)或者 細(xì)針抽吸來收集。
[0047] "乳腺組織樣品"或"乳腺細(xì)胞樣品"是指從被懷疑受乳腺癌困擾或者存在患上乳 腺癌風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體分離的乳腺組織或者流體的樣品。運(yùn)樣的樣品是基礎(chǔ)分離物(不同于培養(yǎng) 的細(xì)胞)并且可W通過任意非介入式方法進(jìn)行收集，所述非介入式方法包括但不限于導(dǎo)管 灌洗法、細(xì)針抽吸法、針式活檢法、W及在美國(guó)專利No.6,328,709中描述的裝置和方法、或 者本領(lǐng)域認(rèn)識(shí)的任意其他合適的方法。作為選擇，"樣品"可W通過介入式方法包括但不限 于外科手術(shù)活檢法進(jìn)行收集。
[0048] "表達(dá)"和"基因表達(dá)"包括核酸材料的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。當(dāng)然，該術(shù)語(yǔ)還可W限于指 (如果有運(yùn)樣指明的話)僅限于核酸的轉(zhuǎn)錄。
[0049] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"包含"及其類似的術(shù)語(yǔ)W它們非封閉式的意思使用；即，等同于 術(shù)語(yǔ)"包括"及其對(duì)應(yīng)的類似的術(shù)語(yǔ)。
[0050] "允許"事件發(fā)生的條件或者"適合"于諸如雜交、鏈延伸此類的事件發(fā)生的"條件" 或者"適當(dāng)"的條件是不妨礙運(yùn)些事件發(fā)生的條件。因此，運(yùn)些條件允許、增強(qiáng)、促進(jìn)和/或引 導(dǎo)所述事件的發(fā)生。運(yùn)些條件，如本領(lǐng)域已知的W及本文所述的，取決于例如核巧酸序列的 性質(zhì)、溫度和緩沖條件。運(yùn)些條件還取決于所希望發(fā)生的事件，例如雜交、切割、鏈延伸或轉(zhuǎn) 5? O
[0051] 本文使用的術(shù)語(yǔ)序列"突變"是指與對(duì)照序列相比本文所公開的感興趣的基因的 序列中所出現(xiàn)的任意序列改變。序列突變包括序列中由諸如取代、缺失或插入之類的機(jī)制 造成的單個(gè)核巧酸變化或者多于一個(gè)核巧酸的改變。單核巧酸多態(tài)性(SNP)也是本文所使 用的一個(gè)突變。因?yàn)楸竟_內(nèi)容基于基因表達(dá)的相對(duì)水平，所W本文所公開的基因的非編 碼區(qū)的突變?cè)谒_內(nèi)容的實(shí)施中也進(jìn)行分析。
[0052] "檢測(cè)"包括任意檢測(cè)方式，包括基因表達(dá)W及其中的變化的直接和間接檢測(cè)。例 如，"檢測(cè)到較少的"產(chǎn)物可W直接觀測(cè)或者間接觀測(cè)，并且該術(shù)語(yǔ)指示任意的降低(包括可 檢測(cè)信號(hào)的缺乏）。類似的，"檢測(cè)到較多的"產(chǎn)物是指任意增加，不管是直接觀測(cè)還是間接 觀測(cè)。
[0053] 所公開的序列的被評(píng)價(jià)的兩個(gè)條件之間的表達(dá)差異（例如高度或低度的復(fù)發(fā)風(fēng) 險(xiǎn))基于所述兩個(gè)條件之間的表達(dá)變化百分比或者倍數(shù)而在如下術(shù)語(yǔ)中定義。兩個(gè)條件之 間的差異可 W 是 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、或者200%。
[0054] 作為選擇，從一個(gè)條件到另一個(gè)條件的倍數(shù)增加或降低可W為1、1.5、2、2.5、3、 3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、或10。
[0055] 除非另有說明，否則本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本公開內(nèi)容所屬的技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。
[0056] 本發(fā)明部分地基于下文將進(jìn)一步討論的若干發(fā)現(xiàn)。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)是兩個(gè)類別方案 (高度風(fēng)險(xiǎn)、低度風(fēng)險(xiǎn))可W有效地被用在BCI分析中W避免現(xiàn)有技術(shù)中中度風(fēng)險(xiǎn)類別的不 確定性。參見例如下文的實(shí)施例2。第二個(gè)發(fā)現(xiàn)是線性BCI模型(BCI-L)對(duì)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)具有比立 方體模型(BCI-C)優(yōu)越的預(yù)后能力。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)允許更簡(jiǎn)單并且更精確地使用BCI來提供預(yù)后 信息例如癌癥復(fù)發(fā)W及預(yù)測(cè)信息例如對(duì)某些療法的反應(yīng)，運(yùn)些信息可W用于選擇療法選 項(xiàng)。因此，BCI可W鑒定具有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低于5%的低度風(fēng)險(xiǎn)組，涵蓋超過60%的乳腺癌患者 (實(shí)施例2)。運(yùn)使得經(jīng)歷過初始療法的超過60%的患者放棄擴(kuò)展治療而幾乎沒有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。
[0057] 作為通過分析本文所公開的表達(dá)模式來確定預(yù)后和/或癌癥復(fù)發(fā)的方法，本文提 供了運(yùn)些優(yōu)點(diǎn)。因此，在先前可能使用主觀解釋來確定癌癥患者的預(yù)后和/或治療的情況 中，運(yùn)個(gè)公開內(nèi)容提供了客觀的基因表達(dá)模式，該基因表達(dá)模式可W單獨(dú)使用或者結(jié)合主 觀標(biāo)準(zhǔn)使用W提供更加精確的患者結(jié)果的評(píng)價(jià)，包括癌癥的復(fù)發(fā)和存活。
[0058] 因此，在一些實(shí)施方式中，提供了確定受乳腺癌困擾的受試者的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的 方法。所述方法包括：（a)確定來自所述受試者的ER+乳腺癌細(xì)胞的樣品中的多個(gè)基因的 mRNA表達(dá)水平；W及根據(jù)在診斷乳腺癌疾病時(shí)所述多個(gè)基因的所述mRNA表達(dá)水平的分析， 對(duì)所述受試者是否具有低度的或者高度的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分類。在運(yùn)個(gè)方法中，所述多 個(gè)基因的分析提供了在接受約5年的輔藥療法后的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，所述癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)在比 較帶有超過5年的結(jié)果或者其代表性樣品的回溯性ER+乳腺癌患者數(shù)據(jù)集時(shí)在低度風(fēng)險(xiǎn)組 中為小于約5%。在很多實(shí)施方式中，所述受試者已經(jīng)接受約5年的輔藥療法并且在該療法 后是沒有疾病的。
[0059] 運(yùn)些方法可W只使用低度和高度的風(fēng)險(xiǎn)分類實(shí)施。在一些替代性的實(shí)施方式中， 也分類有中度風(fēng)險(xiǎn)類別。
[0060] 在一些實(shí)施方式中，所述低度風(fēng)險(xiǎn)組包含超過50%的數(shù)據(jù)集。在其他一些實(shí)施方 式中，所述低度風(fēng)險(xiǎn)組包含超過55%的數(shù)據(jù)集。在另外一些實(shí)施方式中，所述低度風(fēng)險(xiǎn)組包 含超過60 %的數(shù)據(jù)集。
[0061] 運(yùn)些方法可W評(píng)價(jià)任意一段時(shí)間例如5年或者更短、大于5年、第10年、大于10年等 的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。另外，運(yùn)些方法可W評(píng)價(jià)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)和/或局部復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0062] 對(duì)于運(yùn)些方法，可W使用任意多個(gè)基因，前提是當(dāng)分析它們的表達(dá)水平時(shí)，它們能 夠鑒定具有小于5%的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的低度風(fēng)險(xiǎn)組。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)基因中的一個(gè) 基因是化XB13。在其他一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)基因中的一個(gè)基因是IL17BR。在另外一些 實(shí)施方式中，確定化xB13^L17BR化:1)的表達(dá)水平的比例。
[0063] 在另外一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)基因包括MGI基因BublB、CENPA、肥K2、RACGAP1、 和RRM2中的1、2、3、4個(gè)或者所有5個(gè)。在一些實(shí)施方式中，確定BubIB、CENPA、肥K2、RACGAP1、 和RRM2的表達(dá)水平。在運(yùn)些實(shí)施方式中的一些實(shí)施方式中，還確定化XB13/IL17BR化:1)的 表達(dá)水平的比例。在運(yùn)些實(shí)施方式中的各個(gè)方面，對(duì)Bub 1B、CENPA、肥K2、RACGAP1、和RRM2的 表達(dá)水平進(jìn)行求和并且應(yīng)用系數(shù)來獲得MGI指數(shù)，并且將H:I和MGI作為連續(xù)變量組合成BCI 值。
[0064] 在使用BCI的情況下，可W使用本領(lǐng)域已知的任意方式計(jì)算所述BCI。在一些實(shí)施 方式中，通過評(píng)價(jià)個(gè)體癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)作為連續(xù)BCI變量的一部分來計(jì)算BCI，其中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn) 與所述BCI變量成線性關(guān)系地增加。
[0065] 本發(fā)明還設(shè)及確定受乳腺癌困擾的受試者中的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法。所述方法包 括：
[0066] 確定來自所述受試者的ER+乳腺癌細(xì)胞的樣品中的HoxB13、IL17BR、BublB、CENPA、 肥K2、RACGAP1、和RRM2的mRNA表達(dá)水平；
[0067] 對(duì)所述表達(dá)水平進(jìn)行求和W形成乳腺癌指數(shù)(BCI)值，其中，較高的BCI值與較高 的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，并且較低的BCI值與較低的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián);W及
[0068] 根據(jù)BCI值，將所述樣品分類為指示在所述受試者中的癌癥復(fù)發(fā)具有低度風(fēng)險(xiǎn)或 高度風(fēng)險(xiǎn)，且沒有中度風(fēng)險(xiǎn)類別。
[0069] 所述公開內(nèi)容的一些所述方法基于受試者的乳腺癌細(xì)胞中的作為BCI的一部分的 某些基因的表達(dá)水平，包括化XB13的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方式中，使用化XB13表達(dá)和 IL17BR表達(dá)的雙基因的比例（或者化xB13:IL17B化k)(美國(guó)專利申請(qǐng)公報(bào)2005/0239079、 2005/0239083、和2006/0154267)。在乳腺癌指數(shù)的一些替代性的實(shí)施方式中，可W使用 化XB13表達(dá)和CHDH表達(dá)的雙基因的比例。
[0070] 所述化xB13:IL17BR化:1)的比例是根據(jù)能夠預(yù)測(cè)臨床結(jié)果的超越標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后因子 的新型生物標(biāo)記物的研究而得W發(fā)現(xiàn)的。將患上癌癥復(fù)發(fā)的患者與就腫瘤階段和等級(jí)而言 沒有患上癌癥復(fù)發(fā)的那些患者相匹配。發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)單的H:I比適合于預(yù)測(cè)接受輔藥它莫昔芬療 法的雌性激素受體陽(yáng)性化R+)乳腺癌的患者中的癌癥復(fù)發(fā)。隨后的研究(Ma等，2006;Goetz 等，2006; Jerevall等，2007;化nsen等，2007)進(jìn)一步表明運(yùn)個(gè)比例例如通過作為腫瘤進(jìn)展 的指示物不僅具有預(yù)后作用，而且還在回溯性和隨機(jī)臨床試驗(yàn)中具有預(yù)測(cè)它莫昔芬益處 (即，它莫昔芬反應(yīng)/耐受性)的作用。
[0071] 所述BCI包括一種或者多種另外的基因的表達(dá)與化xB13^L17服的表達(dá)的組合。所 述組合可W和如下另外公開的基因中的任意的一個(gè)、兩個(gè)、=個(gè)、四個(gè)或者所有五個(gè)組合。 所公開內(nèi)容的運(yùn)些另外的基因編碼BublB("通過苯并咪挫10而解除對(duì)出芽的抑制(budding uninhibited by benzimidazoles I beta))或者p21 蛋白激活激酶6(PAK6);CENPA(著絲粒 蛋白A,亞型a);肥K2(NIMA相關(guān)激酶2或"從未在有絲分裂基因"，一種相關(guān)激酶2) ;RACGAP1 (Rac GTP酶激活蛋白1);和RRM2(核糖核巧酸還原酶M2)。運(yùn)五個(gè)基因單獨(dú)使用在本文中是 指分子等級(jí)指數(shù)(MGI)。在下文的實(shí)施例2和美國(guó)專利公報(bào)2011/0136680中討論了計(jì)算MGI 的方法。在一些實(shí)施方式中，MGI通過使用用于每個(gè)基因表達(dá)水平的系數(shù)對(duì)BublB、CENPA、 肥K2、RACGAP1、和RRM2的表達(dá)水平進(jìn)行求和來計(jì)算。所述系數(shù)通過本領(lǐng)域已知的任意方法 進(jìn)行確定。在各種實(shí)施方式中，所述系數(shù)根據(jù)主分量分析進(jìn)行確定。
[0072] 所述公開內(nèi)容的多個(gè)方面包括結(jié)合上述五種基因中的一個(gè)或者多個(gè)的表達(dá)水平 針對(duì)化XB13表達(dá)W及IU7BR表達(dá)的使用所描述的組合物和方法，W研究、提供預(yù)后信息和/ 或提供臨床反應(yīng)的預(yù)測(cè)作用。
[0073] H術(shù)5個(gè)MGT甚巧#細(xì)脯偏巧中且有化巧并日據(jù)巧迸略值親化如下，
[0074]
[00巧]運(yùn)些基因的身份細(xì)節(jié)請(qǐng)參見PCT專利公報(bào)W0/2012/079059。
[0076] 因此，所述公開內(nèi)容部分地基于基因表達(dá)水平能夠用來提供受試者的預(yù)后和預(yù)測(cè) 決定的發(fā)現(xiàn)。所有所發(fā)現(xiàn)的屯種基因的使用稱為乳腺癌指數(shù)(BCI)。
[0077] 如在實(shí)施例中所展示的那樣，BCI通過將在內(nèi)分泌療法、祀向療法或者使用芳香化 酶抑制劑治療的從初期到五年的過程中具有中度風(fēng)險(xiǎn)的受試者分為低度風(fēng)險(xiǎn)或者高度風(fēng) 險(xiǎn)而提供了乳腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)越分層。因此BCI比其他同代基因表達(dá)標(biāo)簽優(yōu)越，因?yàn)?每個(gè)時(shí)間段鑒定兩種而不是=種不同風(fēng)險(xiǎn)組(通過針對(duì)前期復(fù)發(fā)將中度和低度風(fēng)險(xiǎn)一起分 組并且針對(duì)后期復(fù)發(fā)將中度和高度風(fēng)險(xiǎn)一起分組)允許消除了能夠占多達(dá)40%的雌性激素 受體陽(yáng)性乳腺癌患者的中度風(fēng)險(xiǎn)類別。在一些情況中，將BCI應(yīng)用于后期疾病復(fù)發(fā)的情況 中，因?yàn)樗蒞得到一種能夠鑒定出可能避免擴(kuò)展輔藥內(nèi)分泌療法及其副作用的患者的方 法。
[0078] 臨床病理學(xué)因子如結(jié)節(jié)狀態(tài)和腫瘤尺寸與較高度風(fēng)險(xiǎn)的后期復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián);但是， 本文所公開的結(jié)果是一種細(xì)化，允許進(jìn)行后期復(fù)發(fā)的個(gè)性化評(píng)價(jià)，并且提供在預(yù)后效能中 超出臨床病理學(xué)因子的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的改善。換句話說，所述公開內(nèi)容的所述方法可 W在沒有使用或者可選地結(jié)合使用臨床病理學(xué)因子如結(jié)節(jié)狀體和腫瘤尺寸的情況下實(shí)施。 其他基于基因表達(dá)的分析化ndoPredict和PAM 50)具有超出臨床病理學(xué)因子的預(yù)后能力。 運(yùn)些研究進(jìn)一步證實(shí)針對(duì)后期疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)的基于分子的分析的臨床使用。
[0079] 為了在實(shí)施本公開內(nèi)容中確定基因的表達(dá)水平，可W使用本領(lǐng)域中任意已知的方 法。在一些實(shí)施方式中，使用基于與本文所公開和鑒定的基因雜交的mRNA的表達(dá)的檢測(cè)。運(yùn) 容易通過本領(lǐng)域中已知或者認(rèn)為等效的任意mRNA檢測(cè)或者擴(kuò)增+檢測(cè)方法進(jìn)行，運(yùn)些方法 包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄PCR、在美國(guó)專利6,794,141中公開的方法W及用于檢測(cè)RNA穩(wěn)定化或 者去穩(wěn)定序列的存在或不存在的方法。在各種實(shí)施方式中，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA。
[0080] 區(qū)分能力是由對(duì)相關(guān)的各個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行的鑒定提供，而不是由用于確定實(shí)際 表達(dá)水平的分析的形式提供。分析可W使用本文所公開的被鑒定的個(gè)體基因的任意鑒定特 征，只要該分析反映（不管是定量地還是定性地)該基因在"轉(zhuǎn)錄體"（基因組中基因被轉(zhuǎn)錄 的部分)或者"蛋白體"（基因組中被表達(dá)基因的被翻譯部分）中的表達(dá)。鑒定特征包括但不 限于用于編碼(DNA)或者表達(dá)(RNA)的獨(dú)特的核酸序列，所述基因或者表位對(duì)被得到基因編 碼的蛋白具有特異性或者具有活性。需要的只是該基因的身份，運(yùn)對(duì)區(qū)分癌癥結(jié)果和在表 達(dá)分析中使用的適當(dāng)?shù)暮?xì)胞樣品而言是必要的。類似地，含細(xì)胞樣品的性質(zhì)不受限制，因 為在所公開的方法中可W使用新鮮的組織、新冷凍的組織W及固定的組織，如福爾馬林固 定-石蠟包埋(FFPE)組織。
[0081] 還可W使用基于表達(dá)的對(duì)蛋白水平或活性的存在、升高或降低的檢測(cè)。所述檢測(cè) 可W采用用于蛋白檢測(cè)的本領(lǐng)域已知并且認(rèn)為合適的基于免疫組織化學(xué)的方法、基于血液 的方法