(特別是對于分泌蛋白）、基于抗體(包括抗該蛋白的自體抗體）的方法、基于脫落細 胞(來自癌癥）的方法、基于質(zhì)譜的方法、基于圖像(包括使用標記配體)的方法?；诳贵w和 圖像的方法另外可用于通過使用W非介入式程序(例如導管灌洗法或細針抽吸法)獲得的 細胞確定癌癥后的腫瘤的定位，其中，癌細胞來源是未知的。可W使用標記的抗體或配體來 定位患者中的癌癥。
[0082] 使用基于核酸的分析來確定表達的一個實施方式是通過將本文鑒定的基因的一 個或者多個序列固定在固體支持物上，所述固體支持物包括但不限于固體基底如本領域已 知的陣列或珠子或者基于珠子的技術。作為選擇，還可W使用本領域已知的基于溶液的表 達分析法。
[0083] 被固定的基因可W是對于該基因來說是獨特的或者特異的多核巧酸形式，使得所 述多核巧酸將能夠與和該基因?qū)腄NA或RNA雜交。運些多核巧酸可W是該基因的全長形 式，或者該基因的短序列形式(直至比本領域已知的全長序列短一個核巧酸，例如，通過從 該序列的5'或3'末端缺失），其可選地受到最小的破壞(通過失配或插入非互補堿基對），使 得不影響與和該基因?qū)腄NA或RNA雜交。在一些情況中，使用的多核巧酸來自于該基因 的3'末端，例如從該基因或者表達序列的多腺巧化信號或者多腺巧化位點的約350、約300、 約250、約200、約150、約100、或約50個核巧酸范圍內(nèi)。
[0084] 本領域技術人員完全能夠針對運些基因的每一個基因比對任意兩個或者多個已 知表達序列W鑒定身份或保守變化的區(qū)域作為在與其他基因的比較中唯一鑒定運些基因 中的每一個基因的區(qū)域。而且，本領域技術人員完全能夠針對運些基因中的每一個基因比 對任意兩個或者多個已知表達序列，W鑒定對所述表達序列的一個或者多個而言是獨特的 區(qū)域作為相對于至少一個其他表達序列唯一地鑒定一個已知的表達序列的區(qū)域。作為一個 非限制性示例，獨特區(qū)域可W為一個已知基因的表達序列的一個變體，使得該區(qū)域可W被 用來鑒定所述變體的表達。
[0085] 相同基因的序列也已經(jīng)從其他動物物種中得到鑒定和表征。因此，本領域的技術 人員清楚地了解到如何相對于其他動物基因鑒定所公開的基因。本領域技術人員還可W可 選地比較來自不同動物來源的所公開的基因的已知序列W鑒定相對于其他基因而言對運 些基因來說是獨特的保守區(qū)域和序列。
[0086] 還可W使用相對于所公開的基因的序列而言包含突變的多核巧酸，只要突變的存 在仍然能夠雜交W產(chǎn)生可檢測的信號。被固定的基因可W被用來確定從樣品受試者的結(jié)果 是未知的或者用于確定已經(jīng)分配給所述樣品受試者的結(jié)果的樣品癌癥或乳腺、細胞制得的 核酸樣品的狀態(tài)。沒有限制所公開的內(nèi)容的意思，運種細胞可W來自患有ER+乳腺癌的患 者。被固定的多核巧酸只需要足W在適當?shù)臈l件下特異地與來自該樣品的對應核酸分子雜 交。
[0087] 如本領域技術人員將理解的那樣，上述提及的一些對應序列包括對所公開的序列 的獨特性沒有貢獻的3'polyA(或互補鏈上的polyT)鏈。所述公開內(nèi)容因此可W使用缺少3' polyA(或者polyT)鏈的序列實施。所公開序列的獨特性是指該序列的僅在所公開基因的核 酸中發(fā)現(xiàn)的部分或者整體，包括在該基因的3'非翻譯部分發(fā)現(xiàn)的獨特序列。用于實踐所述 公開內(nèi)容的優(yōu)選的獨特序列是對=組中的每一個的保守序列有貢獻的那些序列，使得獨特 序列將被用來檢測各種個體的表達，而不是對存在于一些個體中的多核巧酸具有獨特性。 作為選擇，可W使用對個體或者亞群具有獨特性的序列。優(yōu)選的獨特序列優(yōu)選具有所述公 開內(nèi)容的本文所討論的多核巧酸的長度。
[0088] 還可W使用用于鑒定提高的RNA穩(wěn)定性（導致觀察到表達提高）或者降低的RNA穩(wěn) 定性(導致觀察到表達降低）的方法。運些方法包括檢測提高或者降低含有該基因的序列的 mRNA的穩(wěn)定性的序列。
[0089] 運些方法還包括檢測提高的mRNA降解。在所述公開內(nèi)容的一些實施方式中，使用 具有存在于上述公開的序列的3'非翻譯區(qū)和/或非編碼區(qū)中的序列的多核巧酸來檢測癌 癥、或者乳腺、細胞中的基因序列的表達水平。運些多核巧酸可W可選地含有見于上述所公 開的序列的編碼區(qū)的3'部分的序列。
[0090] 含有來自編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)的序列的組合的多核巧酸具有連續(xù)布置的序列而 沒有插入異源序列。
[0091] 作為選擇，所述公開內(nèi)容可W采用具有存在于癌癥、乳腺或細胞中的基因序列的 5'非翻譯區(qū)和/或非編碼區(qū)的序列的多核巧酸來實施，W檢測它們的表達水平。運些多核巧 酸可W可選地含有見于編碼區(qū)的5'部分的序列。含有來自編碼區(qū)和5'非編碼區(qū)的序列的組 合的多核巧酸優(yōu)選具有連續(xù)布置的序列而沒有插入異源序列。所述公開內(nèi)容還可W使用存 在于所公開的基因序列的編碼區(qū)的序列來實施。
[0092] 非限制性多核巧酸含有來自3'或5'非翻譯區(qū)和/或非編碼區(qū)的至少約20、至少約 22、至少約24、至少約26、至少約28、至少約30、至少約32、至少約34、至少約36、至少約38、至 少約40、至少約42、至少約44、或至少約46個連續(xù)核巧酸的序列。在前一句中使用的術語 "約"是指所述數(shù)值增加1或者減去1。甚至更優(yōu)選的是含有至少或約50、至少或約100、至少 約或150、至少或約200、至少或約250、至少或約300、至少或約350、或至少或約400個連續(xù)核 巧酸的的序列的多核巧酸。前一句中使用的術語"約"是指所述數(shù)值增加10%或者降低 10%。
[0093] 來自見于所述公開內(nèi)容的多核巧酸中的上述編碼區(qū)的3'或5'末端的序列具有與 上述那些相同的長度，不同之處在于它們將天然地受到編碼區(qū)的長度的限制。編碼區(qū)的3' 末端可W包含不超過所述編碼區(qū)的3'半部的序列。相反，編碼區(qū)的5'末端可W包含長達所 述編碼區(qū)的5'半部的序列。當然，上述序列或者編碼區(qū)W及含有它們的多核巧酸可W W其 整體使用。
[0094] 含有來自3'非翻譯區(qū)和/或非編碼區(qū)W及所述編碼區(qū)的相關聯(lián)的3'末端的序列的 多核巧酸可W為至少或約100、至少約或150、至少或約200、至少或約250、至少或約300、至 少或約350、或至少或約400個連續(xù)的核巧酸。優(yōu)選的是，所使用的多核巧酸來自該基因的3' 末端，例如從所述基因或表達序列的多腺巧化信號或多腺巧化位點開始在350、約300、約 250、約200、約150、約100、或約50個核巧酸之內(nèi)。相對于所公開的基因的序列含有突變的多 核巧酸也可W使用，只要突變的存在仍然允許雜交W產(chǎn)生可檢測的信號。
[0095] 在所述公開內(nèi)容的另一個實施方式中，可W使用含有從上述所公開的序列的5' 和/或3'末端缺失的核巧酸的多核巧酸。所述缺失優(yōu)選為從5'和/或3'末端缺失1-5、5-10、 10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-125、125-150、150-175、或175-200個核巧酸，不過所述缺失的程度自然受到所述 序列的長度的限制，并且需要能夠使用所述多核巧酸來檢測表達水平。
[0096] 所述公開內(nèi)容的來自上述所公開的序列的3'末端的其他多核巧酸包括用于定量 PCR的引物和可選的探針的那些多核巧酸。在一些實施方式中，所述引物和探針是從基因或 者表達序列的多腺巧化信號或多腺巧化位點擴增少于約350、少于約300、少于約250、少于 約200、少于約150、少于約100、或少于約50個核巧酸的那些。
[0097] 在所述公開內(nèi)容的另外一些其他實施方式中，可W使用含有上述所公開的序列的 部分包括3'末端的多核巧酸。運種多核巧酸將含有從所公開的序列的3'末端開始的至少或 約50、至少或約100、至少約或150、至少或約200、至少或約250、至少或約300、至少或約350、 或至少或約400個連續(xù)核巧酸。
[0098] 所述公開內(nèi)容還包括用于檢測乳腺癌細胞中的基因表達的多核巧酸。運些多核巧 酸包含由見于上述基因的序列W及天然不見到與該序列組合的異源序列的組合組成的較 短的多核巧酸。非限定性示例包括來自克隆載體或者存在于用于制備本文所述的標記探針 或引物的限制片段的短序列。
[0099] 所需的表達水平可能是針對所使用的基因通過本文所述的方法鑒定的水平。另 夕h所述分析可W包括可選地用于PCR(聚合酶連鎖反應)或其他分析方法從樣品制備RNA， 如本文所述。PCR方法可選地為RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-PCR)或定量PCR，如實時RT-PCR。作為選擇， 所述分析可W通過使用陣列例如微陣列、通過新一代測序法、或通過本領域已知的任意其 他方法進行?？蛇x的是，癌癥細胞的樣品可W切取自從上述受試者取下或獲得的組織。如本 文所述，可W使用各種類型的樣品，包括作為一個非限定性示例的福爾馬林固定-石蠟包埋 (FFPE)樣品。并且如本文所述，所述方法可W包括分析或確定本文所公開的樣品中的H:I比 化OXB13和IL17BR的表達水平的比例）。
[0100] W非限定性示例為例，可W分析并使用MGI的所有五個基因來檢測與MGI的"高度 風險"的值相對應的表達水平巧高于臨界值）、或檢測與MGI的"低度風險"的值相對應的表 達水平(其等于或低于臨界值），如本文所公開的那樣。在一些情況中，MGI臨界闊值可W是0 (零），例如使用1的標準偏差將表達水平的測量結(jié)果標準化為〇(零)的情況中。在一些替代 性的實施方式中，臨界值可W為等于或約0.05、等于或約0.10、等于或約0.15、等于或約 0.20、等于或約0.25、等于或約-0.05、等于或約-0.10、等于或約-0.15、等于或約-0.20、等 于或約-0.25、等于或約-0.30、等于或約-0.35、等于或約-0.40、等于或約-0.45、等于或約- 0.50、等于或約-0.55、等于或約-0.60、等于或約-0.65、等于或約-0.70、等于或約-0.75、等 于或約-0.80、等于或約-0.85、等于或約-0.90、等于或約-0.95、等于或約-1.0、等于或約-1.1、等于或約-1.2、等于或約-1.3、等于或約-1.4、等于或約-1.5、等于或約-1.6、等于或 約-1.7、等于或約-1.8、等于或約-1.9、等于或約-2.0或者更低。關于H: I比，其測定可W根 據(jù)在Ma等(2004)和Ma等(2006)中所述進行。例如，0.06的值可W被用來確定樣品具有"高度 風險"（〉0.06)還是"低度風險"（0.06)的H: I比。
[0101] 因此，所有五個基因使用作為MGI的一個非限定性示例的0(零）的闊值或臨界值， 所公開的方法針對一個給定的樣品提供了兩種可能的分析結(jié)果：與大于〇(零）的值對應的 "高度風險MGI"和與0(零)的值對應的"低度風險MGI" /'高度風險MGI"指示"高度風險"癌癥 包括乳腺癌，運類似于本領域已知的方法和標準所定義的等級III腫瘤的情況。"低度風險 MGI"指示"低度風險"癌癥包括乳腺癌，運類似于本領域已知的方法和標準所定義的等級I 腫瘤的情況。
[0102] 用于確定中度風險的癌癥復發(fā)的闊值或臨界值可W為本文公開的那些，或者處在 其約2%、4%、6%、8%、10%'12%'14%、16%'18%'20%'25%'30%'35%'40%'50%、 60%、70%、80%、90%、100% 或者更多之內(nèi)。
[0103] 作為一個非限定性示例，癌癥細胞可W是來自用于診斷受試者中的癌癥的手術前 組織樣品或活檢樣品打開一個樣品。對于患有原位導管癌(DCIS)的運種受試者，目前用于 除去DCIS的護理標準是手術，且乳腺保留手術優(yōu)于根治性乳房切除術。運一般會跟著術后 放射性治療，可選地采用內(nèi)分泌療法，例如使用它莫昔芬、選擇性雌性激素受體調(diào)節(jié)物 (SERM)、選擇性雌性激素受體調(diào)低調(diào)節(jié)物（沈RD)、芳香化酶抑制劑(Al)如來曲挫進行的治 療、祀向療法如抗-mTOR治療（如采用Afmitor?)或抗-皿R2治療（如采用Here巧tin⑥） 和/或使用本領域已知的任意化合物進行的化學療法。
[0104] 當然，基因表達的檢測和BCI的確定可W在如本文所述的任意適當?shù)暮毎麡悠?中進行。在所述公開內(nèi)容中使用的細胞的非限定性示例包括新鮮分離自所述受試者的那些 細胞、分離后冷凍的那些細胞W及固定和/或包埋(例如福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE))的 那些細胞。在大多數(shù)實施方式中，所述細胞是乳腺細胞，例如乳腺癌細胞。
[0105] 如本文所述公開的那樣，BCI被用來確定受乳腺癌困擾的患者中的癌癥復發(fā)風險。 后期復發(fā)的非限定性示例包括使用芳香化酶抑制劑進行的治療、祀向療法或內(nèi)分泌療法例 如它莫昔芬后5年的情況，但是還包括治療4年后、3年后、2年后或更少的時間的情況。類似 的，可W在上述時間段之后使用BCI來預測對抗芳香化酶治療如阿那曲挫或來曲挫治療、祀 向療法或抗雌性激素治療的反應。
[0106] 在一些實施方式中，本文所公開的方法可W有利地用在來自所述受試者的含有乳 腺癌細胞的樣品，例如DCIS樣品，不過本文所述的方法可W使用任意類型的乳腺癌，包括任 意非侵潤性或侵潤性乳腺癌，如侵潤性導管癌、侵潤性小葉癌、炎性乳腺癌、男性乳腺癌、轉(zhuǎn) 移性乳腺癌、復發(fā)性乳腺癌、乳頭狀癌、=陰性乳腺癌、乳頭佩吉特病、乳腺癌、髓樣癌、管狀 癌、粘液癌、化生性癌、腺樣囊性癌、乳腺葉狀腫瘤和血管肉瘤。
[0107] 如在下文實施例2中所討論的那樣，使用BCI的復發(fā)風險可W被分類為低度風險和 高度風險，沒有中度風險類別，并且沒有失去精確度。在運種方案中，中度分類，如所述的那 樣，例如在美國專利公報2013/0281502(參見例如其中的表2)中所述的那樣，當復發(fā)風險在 5年或更短(例如4、3、2或I年)被分類時可W和低度風險組一起分組，當復發(fā)風險在超過5年 或更長(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多年)被分類時可^和高度風險組一起分 組。
[010引當BCI被標定在1至10(例如參見圖3、6和8)時，中度組在5至6.5的BCI分之間。如上 文所討論的那樣，當BCI被標定在1至10的范圍并且5年或更短的復發(fā)風險被分類時，可W將 中度組加入到低度風險組。低度(+中度)風險和高度風險組之間的臨界值因此為中度組遇 到高度風險組的情況，即，約6.5，例如5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.6、 6.7、6.