一種苯并咪唑類hERG鉀離子通道的小分子熒光探針及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苯并咪唑類hERG鉀離子通道的小分子 熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類果幡相關(guān)基因 （human ether-a-go-go related gene，hERG)是從人類海馬 基因中分離鑒定得出，與果蠅EAG基因具有同源性。hERG基因編碼心臟快速激活延遲整流 (Ife)鉀離子通道的α亞基，此通道主要存在于心臟組織及神經(jīng)系統(tǒng)，在心臟動作電位復(fù)極 化過程中發(fā)揮重要作用。近來人們發(fā)現(xiàn)hERG在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的增殖 和凋亡具有調(diào)節(jié)作用。hERG基因的突變或hERG通道被阻滯時，會造成遺傳性或獲得性長 QT間期綜合征（LQTS)，進而引發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速、心室纖顫甚至發(fā)生猝死。
[0003] 對于一些臨床藥物或新藥候選藥物所表現(xiàn)出的心臟毒性，許多研宄表明是由于對 心肌細(xì)胞的hERG鉀離子通道產(chǎn)生阻滯從而導(dǎo)致LQTS。hERG通道作為III類抗心律失常藥物 的作用靶點，對其產(chǎn)生抑制作用的主要為心臟用藥，如抗心律失常藥（多非利特）、抗心絞 痛藥（芐普地爾）和強心藥（哌克昔林），另外，其他一些非心臟藥物也可阻斷該通道，如抗 精神失常藥（氯丙嗪）、抗組胺藥（特非那定）、胃腸動力藥（西沙比利）等。由于藥物與 hERG鉀離子通道較高的親和力而產(chǎn)生長QT間期綜合征，目前，在新藥臨床前研宄中都應(yīng)進 行心臟毒性的安全性評價，而hERG鉀離子通道已作為藥物心臟毒性篩選的重要靶標(biāo)。
[0004] 研宄表明，hERG基因的表達(dá)在許多腫瘤細(xì)胞系中顯著上調(diào)，如結(jié)腸癌細(xì)胞 (HT-29)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y)、胃癌細(xì)胞（SGC7901)，人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7)等。 hERG鉀離子通道與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化及侵襲性密切相關(guān)，而在相應(yīng)來源的正常細(xì)胞 中低表達(dá)或不表達(dá)。另外，對hERG通道有特異性阻斷作用的藥物可以抑制腫瘤細(xì)胞的增 殖。因而hERG鉀離子通道將有可能作為腫瘤治療的藥物靶標(biāo)，并且可以作為腫瘤形成的生 物標(biāo)記物。
[0005] 近年來，用于hERG鉀離子通道的高通量篩選方法有放射性配體結(jié)合實驗、電壓膜 片鉗技術(shù)、及基于熒光探針的檢測方法等。放射性配體結(jié)合實驗，會造成輻射污染。電壓膜 片鉗技術(shù)由于其技術(shù)要求高，需投入較大的人力和物力，不適合大批量化合物的篩選。熒光 探針檢測方法靈敏度高，簡便快捷、不需特殊設(shè)備，被廣泛用于各種生物分析中。目前，用于 鉀離子通道相關(guān)的熒光探針主要采用熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、電壓敏感熒光探 針等，而高選擇性、高靈敏度的小分子熒光探針在鉀離子通道領(lǐng)域的應(yīng)用較少。小分子熒光 探針具有快速、靈敏、高通量和易于自動化等特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸等重要生 物分子的生物學(xué)和藥理學(xué)檢測中，對疾病機制探討、臨床診斷及藥物篩選等領(lǐng)域的發(fā)展具 有重要的意義。小分子探針一般由兩部分組成：藥效基團部分和熒光基團部分。藥效基團 與目標(biāo)生物分子成高親和力結(jié)合，熒光基團通過激發(fā)而發(fā)射熒光以標(biāo)記蛋白質(zhì)。因此，人們 開始嘗試用小分子熒光探針來檢測化合物對hERG離子通道的作用。
[0006] 研宄建立針對hERG鉀離子通道的熒光探針高通量篩選與標(biāo)記的方法，將直接反 映化合物對hERG鉀離子通道的抑制活性，對藥物研發(fā)及臨床前藥物的安全性評價具有重 要意義。近年來，人們發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)hERG鉀離子通道，這為研宄腫瘤細(xì)胞及其 組織提供了新的啟示。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是一種苯并咪唑類hERG鉀 離子通道的小分子熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0009] 一種苯并咪唑類hERG鉀離子通道的小分子熒光探針，該熒光探針的結(jié)構(gòu)通式如 式（I )所示：
[0010]
[0011] 式中，R1為羥基、鹵素、烷基或烷氧基的單取代或多取代基；R2為熒光團；η = 1-6。
[0012] 優(yōu)選的，所述R1為對位鹵素 ；R 2為香豆素類、萘二酰亞胺類、NBD類、Cy5類及異硫 氰酸熒光素類熒光團；η = 4。
[0013] 優(yōu)選的，所述小分子熒光探針選自具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物：
[0014]
[0015] 所述苯并咪唑類小分子熒光探針在hERG鉀離子通道及其高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞或組 織標(biāo)記中的應(yīng)用。
[0016] 所述苯并咪唑類小分子熒光探針可直接反映化合物對hERG鉀離子通道的抑制活 性。
[0017] 所述苯并咪唑類小分子熒光探針在hERG鉀離子通道抑制劑的高通量篩選以及在 新藥心臟毒性評價中的應(yīng)用。
[0018] 所述苯并咪唑類小分子熒光探針在作為識別hERG鉀離子通道的探針以及在hERG 鉀離子通道生理、病理及相關(guān)疾病研宄中的應(yīng)用。
[0019] 一種苯并咪唑類小分子熒光探針的制備方法，包括以下步驟：
[0020] ⑴識別基團的制備：2_氯苯并咪唑在堿性條件（pH = 10~14)下，與對氟芐溴 反應(yīng)3~5h生成1-對氟芐基-2-氯苯并咪唑，再與4-氨基-1-乙氧甲?；哙ぴ谖⒉?(35~50W，150~180°C )的條件下反應(yīng)0· 5~lmin，生成4- ((1-對氟芐基-1H-2-苯并咪 唑基）氨基）-1-哌啶甲酸乙酯，再與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 %~60 %氫溴酸于80~100°C回流生成 1-對氟芐基-N- (4-哌啶基）-1H-2-氨基苯并咪唑溴酸鹽，接著與N- (4-溴丁基）鄰苯二甲 醜亞胺在喊性條件（pH = 9~13)下反應(yīng)8~9h，生成N-(4_ ((4_ ((1_對氣芐基-1H-2-苯 并咪唑基）氨基U-哌啶）丁基）鄰苯二甲酰亞胺，再與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%~80%水合肼反 應(yīng)4~5h，得到N- (1- (4-氨丁基）哌啶基）-1-對氟芐基-1H-2-氨基苯并咪唑；
[0021] (2)探針分子的制備：制備各種熒光團，通過在熒光團上引入羧基，然后與 N- (I- (4-氨丁基）哌啶基）-1-對氟芐基-1H-2-氨基苯并咪唑在EDCI/HOBT/Et3N的 作用下發(fā)生縮合反應(yīng)，室溫反應(yīng)12~14h，制得探針分子；或者在熒光團上引入鹵素，與 N- (1- (4-氨丁基）哌啶基）-1-對氟芐基-1H-2-氨基苯并咪唑，碳酸鉀作縛酸劑，乙腈作溶 劑，于70~80°C回流反應(yīng)6~7h，發(fā)生取代反應(yīng)，制備探針分子。
[0022] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中，2-氯苯并咪唑、對氟芐溴以及4-氨基-1-乙氧甲?；?啶的加入的摩爾比為0. 5~1. 2 :1~1. 8 :1~2。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中，4-氨基-1-乙氧甲?；哙ぁ滗逅?、N-(4_溴丁基）鄰 苯二甲酰亞胺以及水合肼加入的摩爾比為1~1. 8 :50~70 :1. 2~2 :60~80。
[0024] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中，回流時間為30~40h。
[0025] 優(yōu)選的，所述步驟（2)中N-(1-(4-氨丁基）哌啶基）-1-對氟芐基-1H-2-氨基苯 并咪唑、含羧基的熒光團、EDCI、HOBT以及三乙胺加入的摩爾比為0. 5~1. 2 :0. 5~1. 2 : 1 ~2 :1 ~2 :1· 5 ~3〇
[0026] 優(yōu)選的，所述步驟（2)中，N-(1-(4-氨丁基）哌啶基）-1-對氟芐基-1H-2-氨基 苯并咪唑、含鹵素的熒光團、碳酸鉀的摩爾比為0. 5~1. 2 :1~2 :1. 5~3。
[0027] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果為：
[0028] 本發(fā)明的苯并咪唑類小分子熒光探針對hERG鉀離子通道具有高選擇性和高靈敏 度，可以用于hERG鉀離子通道的識別，以及hERG鉀離子通道生理、病理及相關(guān)疾病的研宄； 可用于hERG鉀離子通道抑制劑的篩選，直接反應(yīng)化合物對hERG鉀離子通道的抑制活性，用 于新藥心臟毒性評價的研宄中。
【附圖說明】
[0029] 圖1為Ll與hERG轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞及加入抑制劑的成像結(jié)果；
[0030] 圖2為Ll與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及加入抑制劑的成像結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0032] 實施例1 :香豆素類熒光團探針的制備：
[0033]
[0034] 具體合成路線如下：
[0035]
[0036] (1)中間體1的制備：
[0037] 向2-氯苯并咪挫（5g，32. 7mmol)中加入30ml乙腈和氫氧化鉀（2. 62g，46. 6mmol， 加熱至80°C，攪拌30min，溶液澄清；冷卻至室溫后，加入對氟節(jié)溴（9. 29g，49. lmmol)， 升溫至80°C回流5h，反應(yīng)液呈白色混濁液；將反應(yīng)液用二氯甲烷萃取三次（100mLX3)， 蒸餾水洗滌，合并有機層，無水硫酸鎂干燥，抽濾，濃縮，得白色固體，固體用丙酮/石 油醚重結(jié)晶，冷藏，抽濾，干燥，得白色固體，收率為91.1%。 1H-Nmrgoomhz,dmso): δ =7. 64(d, J = 6. 6Hz, 2H), 7. 32-7. 24(m, 4H), 7. 19(t, J = 4. 9Hz, 2H), 5. 53 (s, 2H)； ESI-MS: ([M+H]+) :261. 6〇
[0038] (2)中間體2的制備：
[0039] 將中間體I (0. 5g，I. 9mmol)與無色油狀物4-氨基-I-乙氧甲?；哙?(0. 495g，2. 8mmol)加入至微波管中，攪拌均勻，微波180°C反應(yīng)lmin，冷卻至室溫，呈 紅棕色固體，用甲醇15mL與二氯甲烷5mL溶解后拌樣，過柱純化，得白色固體，收率為 34.0 %。1H-Nmr(SooMHz1