. 83-7. 75 (m, 2H), 4. 24 (t ,J = 7. 2Hz, 2H), 3. 76 (t, J = 6. 3Hz, 2H), I. 89-1. 79 (m, 2H), I. 74-1. 57 (m, 2H). ESI-MS: ([M+H]+) :327. 5〇
[0062] (3)中間體6的制備：
[0063] 將中間體5(0. 60g，1.84mmol)溶于干燥乙酸乙酯中，再將0. 5mL三溴化磷溶于 5mL干燥乙酸乙酯中得混合物1，將混合物1在冰浴下逐滴加入至中間體5溶液中，滴加完 畢后，轉(zhuǎn)移至油浴80°C，回流反應(yīng)6h。待反應(yīng)液冷卻至室溫，將其倒入碎冰中，析出棕色固 體，抽濾，濾餅用水洗滌，干燥得棕色固體。收率95. 2%。1H-NMR(300MHz，⑶Cl3): δ 8.63 (d ,J = 7. 2Hz, 1H), 8. 60 (d, J = 8. 1Hz, 1H), 8. 39 (brs, 1H), 8. 20 (d, J = 8. 4Hz, 1H), 7. 81-7. 7 5 (m, 2H), 4. 24 (t, J = 6. 9Hz, 2H), 3. 49 (t, J = 6. 3Hz, 2H), 2. 38 (s, 3H), 2. 04-1. 85 (m, 4H)； ESI-MS: ([M+H]+) :389. 4〇
[0064] (4)化合物L(fēng)I的制備：
[0065] 將中間體 3 (90mg，0. 22mmol)與中間體 6 (llOmg，0. 28mmol)溶于 18mL 干燥乙 腈和2mL干燥N, N-二甲基酰亞胺的混合溶液中，再加入無水碳酸鉀（70mg，0. 50mmol), 于80 °C回流反應(yīng)6h。待反應(yīng)液冷卻至室溫，濾去碳酸鉀，將濾液濃縮至大約2mL，過柱 純化，得淡黃色固體，收率為 50. 5 %。1H-NmrGOOMHz, DMSO) : δ 10. 45 (s, 1H)，9. 26 (br s，lH)，8.74(d，J = 12Hz，lH)，8.55(d，J = 12Hz，lH)，8.50(d，J = 12Hz，lH)，8.33(d，J =12Hz, 1H), 7. 91 (t, J = 12Hz, 1H), 7. 23 (s, 3H), 7. 16 (t, J = 12Hz, 3H), 6. 96 (d, J = 36Hz, 2H), 5. 34 (s, 2H), 4. 11 (t, J = 12Hz, 2H), 4. 00 (brs, 1H), 3. 56 (d, J = 12Hz, 2H) ,3.10( brs, 4H), 2. 29 (s, 3H), 2. 23 (d, J = 18Hz, 2H), 2. 03 (brs, 1H), I. 74 (m, 5H) ； 13C-NMR (7 5MHz, C D3OD) : δ 171. 26, 164. 37, 163. 88,140. 06, 133. 22, 131. 80, 131. 48, 131. 02, 128. 78, 128. 73 ,128. 34, 128. 25, 126. 43, 125. 08, 122. 42, 121. 94, 120. 75, 120. 65, 118. 45, 115. 31, 115. 09 ,114. 21, 108. 54, 44. 31, 38. 78, 24. 86, 22. 51, 21. 43. ESI-MS: ([M+H]+) calcd for C37H37FN5O 3:633. 2945, found:633. 3081。
[0066] 實(shí)施例3 :光學(xué)活性的測定
[0067] 表1 :探針分子的光學(xué)特征
[0068]
[0070] 注：以上所有光學(xué)性質(zhì)均在pH = 7. 4的磷酸緩沖液中測量。
[0071] 實(shí)施例4:生物活性的測定
[0072] 以阿司咪唑（Astemizole)為陽性藥，采用放射性配體競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，測定熒光 探針分子與hERG鉀離子通道的結(jié)合活性，結(jié)果如表2所不。合成的探針分子LI、L3、L5的 活性較陽性藥阿司咪唑低，探針L4的活性與阿司咪唑活性相當(dāng)。
[0073] 表2探針分子與hERG鉀離子通道的親和力
[0074]
[0075] 注：IC5tl為化合物與hERG鉀離子通道結(jié)合50%的濃度，K i代表化合物與hERG鉀 離子通道的結(jié)合常數(shù)。
[0076] 實(shí)施例5 :探針分子在hERG鉀離子通道細(xì)胞成像中的應(yīng)用
[0077] 以探針分子Ll為研宄對象，考察其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用，選擇hERG轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y)為陽性細(xì)胞，相同條件下，加入抑制劑阿司咪唑作為陰 性對照。
[0078] 具體步驟為：1^1?轉(zhuǎn)染的冊1(293細(xì)胞用含有10%胎牛血清和40(^8/1^6418的 DMEM培養(yǎng)基；神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y)用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在5% CO2空氣及37°C的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，成像前，將細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)12-24h，將 培養(yǎng)基吸掉，用不含血清的培養(yǎng)基洗滌一次，加入探針Ll (不含血清的培養(yǎng)基配制，濃度為 ΙμΜ);相同條件下，另一小皿加入探針Ll與抑制劑阿司咪唑（不含血清培養(yǎng)基配制，Ll濃 度為1 μ Μ，阿司咪唑濃度為50 μ Μ)作陰性對照，孵育，然后吸出培養(yǎng)基，洗滌一次，用Zeiss Axio Observer Al 成像。
[0079] 成像結(jié)果如圖1和圖2所示，探針分子能夠標(biāo)記hERG鉀離子通道及其高表達(dá)的神 經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y)，該探針在hERG鉀離子通道生理、病理及相關(guān)疾病的研宄中有 廣闊的應(yīng)用前景。
[0080] 上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對發(fā)明保護(hù)范圍 的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需 要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種苯并咪唑類hERG鉀離子通道的小分子熒光探針，該熒光探針的結(jié)構(gòu)通式如式 (I)所示：式中，&為羥基、鹵素、烷基或烷氧基的單取代或多取代基；R2為熒光團(tuán)；n= 1-6。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子熒光探針，其特征在于：所述Ri為對位鹵素；R2為香 豆素類、萘二酰亞胺類、NBD類、Cy5類及異硫氰酸熒光素類熒光團(tuán)；n= 4。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小分子熒光探針，其特征在于：所述小分子熒光探針選自具 有如下結(jié)構(gòu)式的化合物：4. 一種苯并咪唑類小分子熒光探針的制備方法，包括以下步驟： (1)識別基團(tuán)的制備：2_氯苯并咪唑在堿性條件下，與對氟芐溴反應(yīng)，生成1-對氟 芐基-2-氯苯并咪唑，再與4-氨基-1-乙氧甲?；哙ぴ谖⒉?50~180°C的條件下反 應(yīng)，生成4-((1_對氟芐基-1H-2-苯并咪唑基）氨基）-1_哌啶甲酸乙酯，再與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30 %~60 %氫溴酸回流生成1-對氟芐基-N-(4-哌啶基）-lH-2-氨基苯并咪唑溴酸鹽， 接著與N-(4-溴丁基）鄰苯二甲酰亞胺在堿性條件下反應(yīng)，生成N-(4-((4-((l-對氟芐 基-1H-2-苯并咪唑基）氨基）1_哌啶）丁基）鄰苯二甲酰亞胺，再與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%~ 80%水合肼反應(yīng)得到^(1-(4-氨丁基）哌啶基）-1-對氟芐基-111-2-氨基苯并咪唑； (2)探針分子的制備：制備各種熒光團(tuán)，在熒光團(tuán)上引入羧基，然后與N-(l-(4-氨丁 基）哌啶基）-1-對氟芐基-1H-2-氨基苯并咪唑通過縮合反應(yīng)，制得探針分子；或者在熒光 團(tuán)上引入鹵素，與N- (1- (4-氨丁基）哌啶基）-1-對氟芐基-1H-2-氨基苯并咪唑發(fā)生取代 反應(yīng)，制備探針分子。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中，2-氯苯并咪唑、對 氟芐溴以及4-氨基-1-乙氧甲?；哙さ募尤氲哪柋葹?.5~1.2 :1~1.8 :1~2。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中，4-氨基-1-乙氧 甲?；哙ぁ滗逅?、N-(4-溴丁基）鄰苯二甲酰亞胺以及水合肼加入的摩爾比為1~1. 8 : 50 ~70 :1. 2 ~2 :60 ~80。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中，回流時(shí)間為30~ 40h〇8. 權(quán)利要求1-3任一所述苯并咪唑類小分子熒光探針在hERG鉀離子通道及其高表達(dá) 的腫瘤細(xì)胞或組織標(biāo)記中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1-3任一所述苯并咪唑類小分子熒光探針在hERG鉀離子通道抑制劑的高 通量篩選以及在新藥心臟毒性評價(jià)中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1-3任一所述苯并咪唑類小分子熒光探針在作為識別hERG鉀離子通道的 探針以及在hERG鉀離子通道生理、病理及相關(guān)疾病研宄中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種苯并咪唑類hERG鉀離子通道的小分子熒光探針及其制備方法與應(yīng)用，該熒光探針的結(jié)構(gòu)通式如式(Ⅰ)所示：式中，R1為羥基、鹵素、烷基或烷氧基的單取代或多取代基；R2為熒光團(tuán)；n＝1-6，所述R1為對位鹵素；R2為香豆素類、萘二酰亞胺類、NBD類、Cy5類及異硫氰酸熒光素類熒光團(tuán)。在hERG鉀離子通道及其高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞或組織標(biāo)記中、在hERG鉀離子通道抑制劑的高通量篩選以及在新藥心臟毒性評價(jià)中以及在作為識別hERG鉀離子通道的探針以及在hERG鉀離子通道生理、病理及相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用。
【IPC分類】C07D493/10, G01N21/64, C09K11/06, C07D405/14, C07D401/14, C07D401/12
【公開號】CN104910894
【申請?zhí)枴緾N201510224724
【發(fā)明人】杜呂佩, 李敏勇, 汪蓓蕾
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月5日