效濃度"或"有效量"是指在一定條件下，抗污損成分可W發(fā)揮顯著抗污損活性的 含量。例如，依據(jù)成膜成分的總量，抗污損成分的質(zhì)量濃度可達(dá)到約5%、約10%或約15% (w/w)。在工藝化生產(chǎn)中，有效濃度可被定義為能夠有效抑制或減少污損生物的幼蟲和/或 成體附著的濃度，污損生物例如但并不局限于一種或多種藤壺，管蟲和苔薛蟲。
[0038] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于減少海洋污損生物附著于和/或污損水下 物體的表面的抗污損涂料，包含成膜成分和抗污損成分；其中所述成膜成分包含一種或 多種樹脂；并且其中所述抗污損成分包含一種或多種由式I表示的化合物，所述式I為：
[0039]
[0040] 其中R選自H、邸3、C冊肥&地、CsHyN、COCsHyN、CgHeN、化、Ph-4-OH和化-4-OAc。
[0041] 在另一個方面，本發(fā)明還提供了一種防止或減少海洋污損生物附著于和/或污損 水下物體的表面的方法，包括用本發(fā)明所述的抗污損涂料涂布所述水下物體的表面。本發(fā) 明所述的抗污損涂料的涂布量可W為例如，每層抗污損涂料的涂布厚度為120μπι，涂兩層。 例如，針對19cmX 14畑1的表面，可W涂覆總量為400-500血的抗污損涂料。
[0042] 本發(fā)明所述的防污損方法和抗污損化合物可有效防治的海洋污損生物包括但不 限于一種或多種藤壺、管蟲和苔薛蟲。在一個實施方案中，本發(fā)明提供的活性化合物和抗污 損涂料至少可W抑制一種或多種污損生物的附著。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供的活 性化合物和抗污損涂料至少可W抑制一種或多種污損生物的幼蟲的附著。
[0043] 可涂有本發(fā)明所述的化合物和涂料的水下物體包括任何具有可W浸入海洋（包 括含鹽的）水環(huán)境中一段時間的表面的物體。運些物體包括但并不局限于船體的一部分、 排水管道、船舶螺旋獎、網(wǎng)箱、碼頭水下結(jié)構(gòu)、海上石油平臺水下結(jié)構(gòu)、潛艇水雷、浮標(biāo)、海底 電纜和沿海電廠冷卻管。
[0044] 毋需詳述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員會利用上述說明將本發(fā)明利用至最大限度。下面 W說明的方式，而非限制的方式提供實例。雖然在本發(fā)明中提供了具體實例，但是所有描述 均為說明性質(zhì)而非限制性的。上述具體描述的任何一種或多種特征均能與本發(fā)明中的任何 其他實施方案中的一種或多種特征W任意方式組合。此外，通過瀏覽說明書，本領(lǐng)域的技術(shù) 人員會逐漸明了本發(fā)明的多種變化。
[0045] 本申請中引用的所有出版物和專利文件的相關(guān)部分均W引用的方式并入本發(fā)明， 如同分別引用了每個單獨的出版物或?qū)＠募?。通過引用多篇參考文獻(xiàn)，申請人不承認(rèn)任 何特定的參考文獻(xiàn)為本發(fā)明的"現(xiàn)有技術(shù)"。
[0046] 例子
[0047] 在W下實例描述中，進一步W說明而非限定的方式闡述了本發(fā)明所述的方法、化 合物和組成。應(yīng)當(dāng)理解的是，成分的比例變化和要素改變對于技術(shù)人員是顯而易見的，均在 本發(fā)明的范圍之內(nèi)。提供了理論說明，但應(yīng)理解的是，申請人不旨在被所提供的理論束縛。 除非特別說明，否則所有的份或量均W重量計算。
[0048]W下將詳細(xì)闡述實驗材料和方法：
[0049] 菌株分離及鑒定-菌株UST4-50分離自一種紅海海銷。依據(jù)化raishi(1992) 所提供的方法，擴增了其16SrDNA基因，并對16SPCR產(chǎn)物進行了純化。利用Bi曲ye Terminator試劑盒（AppliedBiosystems公司，USA),根據(jù)制造商的說明，對PCR產(chǎn)物 進行了鑒定。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果顯示，菌株UST-450的16SrDNA序列與反硝化假弧菌 (P.denitrificans)菌株NBRC100825 有99%的相似度，故將其鑒定為反硝化假弧菌 (P.denitrificans)。同時，菌株T450的16srDNA序列已提交至GenBank(NCBI)，獲得序列 號為KM196102,正式命名為反硝化假弧菌化denitrificans)菌株UST4-50。實驗中所用 PCR引物由華大基因科技（深圳）有限公司合成；細(xì)菌DNA提取試劑盒、常規(guī)PCR操作所用 試劑和酶W及DNAMarker均購自天根生化科技（北京）有限公司。
[0050]菌株發(fā)酵-對菌株UST4-50進行大規(guī)模發(fā)酵巧化)，發(fā)酵所用培養(yǎng)基為GTY液體培 養(yǎng)基（將2g酵母膏、5g膜蛋白腺、lOg葡萄糖（均購自Sigma公司）和40g紅海海鹽溶于 1L蒸饋水中，pH7. 6)，30°C下置于25化pm搖床培養(yǎng)3. 5天。
[0051]菌株UST4-50次級代謝產(chǎn)物的分離-3. 5天后，室溫條件下（~23°C)，將發(fā)酵液 5000g離屯、30分鐘W去除細(xì)胞，上清用等體積乙酸乙醋巧tOAc)萃取3次，合并乙酸乙醋 層，真空旋轉(zhuǎn)蒸干，最終共得到約5. 5g棟褐色油狀發(fā)酵液乙酸乙醋粗浸膏。
[0052] 將該粗浸膏通過反相柱梯度洗脫共得到5個組分。將運5個組分進行抗紋藤壺 和苔薛蟲幼蟲附著活性測試，選取活性較好的組分通過HPLC進一步分離純化，最終得到8 種化合物。具體而言，粗浸膏巧.5g)首先通過反相C18柱進行初步分離，WMeOH-H2〇混 合液為洗脫相進行梯度洗脫，洗脫后得到5個組分（化.1至化.5)。對化.1-Fr. 5進行抗 污損活性篩選，發(fā)現(xiàn)化.1(MeOH- &01:9洗脫獲得）和化.5(MeOH- &0 9:1洗脫獲得）無 活性，HPLC和UPLC-MS譜圖顯示運兩個組分中的主要化合物為糖類，蛋白和脂肪酸等，屬 于GPY培養(yǎng)基成分；Fr. 2 -Fr. 4在10μg血-1時可W完全抑制紋藤壺化ampitrite)幼 蟲的附著，并表現(xiàn)出中等強度的抑制苔薛蟲度.neritina)幼蟲附著的活性。同時，化.2-化.4中的化合物的紫外吸收和UPLC-MS數(shù)據(jù)分析結(jié)果與初篩時得到的該菌株的粗浸膏的 相關(guān)數(shù)據(jù)基本吻合?；?2 -化.5的具體分離過程如下：化.2化46g)進一步通過反相C18 柱分離，WMeOH-HzO(3:7-5:5)洗脫得到化合物6 (1. 5mg);化.3 0). 61g)依次經(jīng)過Se地adex LH-20柱，C肥Is-MeOH1:1洗脫，得到組分化.3.U〇.llg)和化.3. 2 (0. 05g)，運兩個組分 分別進行半制備HPLC(LunaC18, 5μm，10X250mm，2mL/分鐘）（高效液相色譜儀購自美國 Waters公司），MeOH-HzO4:6 為流動相，得到化合物 3(2. 5mg)和 5(1. 9mg);化.4(1. 7g) 通過陽-EA梯度洗脫（50 % -90 % )硅膠柱得到化.4. 1 -化.4. 3,其中，化.4. 1 (1.Og) 進行半制備HPLC(MeOH-H2〇 67:33)得到化合物8(200mg)，化.4. 2(0. 5g)通過反相C18 柱，WMeOH-HzO(65:35-90:10)梯度洗脫得到化合物 1 (35mg)，2 化 7mg)和 4 (1.Img)， 化.4. 3 〇). 26g)進一步進行半制備HPLC(MeOH-H2〇 85:15)得到化合物 7 (2. 4mg)。
[0053] 菌株UST4-50次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定-對上述化合物1-8進行iH-NMR譜和 UPLC-MS譜鑒定。iH-NMR譜圖在室溫下通過巧0LDRX500監(jiān)NMR(瑞:t化址er公司）測定， 所選溶劑為気代二甲基亞諷（DMSO-de) (D址san公司），WTMS為內(nèi)參。UPLC-MS譜圖通過 UPLC(WatersAC卵ITY公司，USA)-MicroTOF-MSsystem度rukerDaltonicsGmbH,布萊梅， 德國）測定。
[0054] 雙嗎I噪生物堿類化合物3, 3' -二嗎I噪基甲燒值IM)的抗污損活性測試-紋藤壺 度.amphitrite)成體采自香港西貢碼頭（22° 38'N，114° 27'巧的橋梁柱粧上，將新鮮 取得的成體帶回實驗室后，放入盛有新鮮過濾化22μm)海水（FSW)的玻璃缸內(nèi)，在黑暗環(huán) 境中催出幼體，并利用幼蟲趨光性進行幼體的捜集，得到無節(jié)幼蟲。無節(jié)幼蟲的培養(yǎng)方法如 Harder等（2001)的描述，在28°C恒溫箱（德國ThermoScientific公司）中，W纖細(xì)角毛 藻（Qiaetocerosgracilis)Schutt( -種娃藻）為巧料（1X106cells血i)，使用加壓累向 養(yǎng)殖容器中的海水中輔W適量的空氣，每24小時換一次水，取樣觀察幼蟲發(fā)育狀態(tài)，大約 3. 5-3. 8天后大部分幼蟲進入金星幼蟲狀態(tài)。將金星幼蟲捜集過濾并保存在盛有FSW的玻 璃培養(yǎng)皿中，隨后幼蟲被放置在4Γ冰箱中過夜待用。
[0055] 苔薛蟲度.neritina)采自香港格樹澳（22° 24'N，114° 21'巧的漁排和浮俊 上，將采到的苔薛蟲成體放置在水槽中，確保水槽中的海水流動性并通入適量空氣，一般成 體可在室溫（~23°C)流動的海水中成活屯天左右，在此期間取苔薛蟲成體釋放幼蟲進行 活性測試。參照Maki等.（1989)中所述的方法，取適量苔薛蟲成體放入盛有FSW的玻璃缸 中，將其置于光照條件下催促其釋放幼體，20-30分鐘后開始有幼體釋放，收集游動活躍的 幼蟲，將收集到的幼蟲盡快用于活性測試。
[0056] 評價本發(fā)明所述化合物對紋藤壺化amphitrite)和苔薛蟲度.neritina)的抑制 效果的實驗在24孔聚苯乙締板中（Nunc,Naperville,IL公司，CA,USA)進行。待測乙酸 乙醋粗浸膏溶于DMS0,滿旋振蕩確保完全溶解，配制成50mgmL1的母液，將滿旋振蕩后的 母液簡單離屯、，至EP管壁無液滴存在且沒有不溶物沉淀為宜。依據(jù)活性菌株篩選實驗需 求，將母液逐倍稀釋至不同濃度使用。具體而言：用FSW將母液稀釋1000倍至50μg血1， 進一步系列稀釋2倍，得到濃度為25至0. 39μgmL1的7種濃度的待測溶液。在24孔板 (Nunc，USA)的每個孔中放置山L的待測溶液，然后向每個盛有待測液的孔中加入15-20只 幼蟲。每種待測溶液設(shè)Ξ個重復(fù)。同時，用ImLDMS0-FSW(vM:1000)作為陰性對照組； 用1血含有1. 90μg血1 (ECs。值用于紋藤壺化amphitrite))Sea-Nine211TM的待測液和 1血含有2. 50yg血1巧Cg。值用于苔薛蟲度.ne;ritina))Sea-化ne211TM的待測液作為陽 性對照組（Li等.，2013)。將24孔板置于28°C生化恒溫培養(yǎng)箱中于黑暗條件下培養(yǎng)。48 小時后，取出24孔板，將其放置在體視顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察，并詳細(xì)記錄游 動、附著和死亡幼蟲的數(shù)目。每個檢驗設(shè)置Ξ個重復(fù)，并且用Ξ批不同的幼蟲重復(fù)Ξ次。
[0057] 幼蟲附著率（％ )=(附著幼蟲個數(shù)/總幼蟲個數(shù)）X100%
[005引幼蟲死亡率（％ )=(死亡幼體個數(shù)/總幼蟲個數(shù)）X100%
[0059] ECs。和LCs。值的計算-在實驗結(jié)果中，污損生物的幼蟲附著率和死亡率依照上述 公式計算，用百分比來表示。ECs。（半數(shù)抑制濃度）和LCs。（半數(shù)致死濃度）值通常用來評 估防污劑的抗污損活性及其毒性，其中，ECw值是指與陰性對照組相比，50%的幼蟲被抑制 附著的濃度；LCs。值則為與陰性對照組相比，50%幼蟲死亡時的防污劑濃度值。對于已得實 驗數(shù)據(jù)，應(yīng)用Probit軟件進行處理并作圖，得到濃度-附著率（或死亡率）曲線，根據(jù)該 曲線計算出每種化合物的ECw和LCw值。采用單因素方差分析（AN0VA)對數(shù)據(jù)進行分析， 確定顯著性差異（P<〇.05)。
[0060] 化合物4-徑苯基-3, 3' -二嗎I噪基甲燒（DIM-Ph-4-OH)的乙酷化-將 DIM-Ph-4-0H(3mg)溶于ImL化晚試劑，然后在成氣氛下向該溶液中加入醋酸酢（0. 5mL)，將 混合液于室溫（~23°C)條件下成保護震蕩24小時。24小時后加入0. 3mL雙蒸水停止該 反應(yīng)，用二氯甲燒值CM)萃取混合液得到DCM相。然后用飽和化C1溶液清洗DCM相，隨后用 無水Na2S〇4干燥，并真空離屯、蒸發(fā)濃縮器（SpeedVac)(美國ThermoFisher公司）真空蒸干 濃縮得到紅色反應(yīng)產(chǎn)物。將紅色反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過半制備HPLC分離純化（半制備柱化enomenex C18colrnnn(250X10mm, 7μm)購自Phenomenex公司），最終得到目標(biāo)產(chǎn)物 8a(2. 8mg，紅色 粉末，83%收率）。所有反應(yīng)均在室溫下進行（23°C)。
[0061] 復(fù)蘇實驗-為了測試抗污損化合物對祀向生物的毒性，對DIM和DIM-Ph-