4-OH 進(jìn)行了紋藤壺幼蟲(chóng)復(fù)蘇效果測(cè)試。將DIM(25. 39μΜ，抑制大約100 %附著）和 DIM-Ph-4-0H(73. 93μΜ，抑制大約100%附著）的待測(cè)液加入盛有15 - 20只紋藤壺幼蟲(chóng)的 24孔板中，把運(yùn)些24孔板于室溫（~23°C)避光條件下放置24小時(shí)。24小時(shí)后，取出各 個(gè)濃度下的幼蟲(chóng)，并用FSW清洗幼蟲(chóng)Ξ遍，然后將清洗后的幼蟲(chóng)重新置于盛有ImLFSW的24 孔板中，將運(yùn)些24孔板在室溫（~23°C)黑暗條件下放置48小時(shí)。48小時(shí)后，使用顯微 鏡（日本Olympus公司）觀察幼蟲(chóng)活動(dòng)狀態(tài)，并記錄游動(dòng)、附著和死亡幼蟲(chóng)的數(shù)目。在本實(shí) 驗(yàn)中，陰性對(duì)照組為FSW和含有0. 1 %DMS0的FSW，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。
[0062] 海區(qū)野外掛板實(shí)驗(yàn)-對(duì)DIM進(jìn)行了野外掛板抗污損活性測(cè)試，測(cè)試在3個(gè)質(zhì)量濃 度（w/w5%，10%和15% )條件下進(jìn)行。防污漆的制作在文獻(xiàn)"Skattebol等（2006)"和 "Xu等（2010)"所報(bào)道的防污漆制備工藝的基礎(chǔ)上稍微進(jìn)行了改進(jìn)，PVC板涂層的具體制備 過(guò)程如下：
[0063] 1)聚氯乙締（PVC)板的準(zhǔn)備：PVC板由香港科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)工程部人員打磨切割成 規(guī)格為19cmX14cmX3mm的長(zhǎng)方形板，并在四角邊緣處打孔（直徑為1cm)便于懸掛。將切 割好的PVC板用砂紙打磨其表面，使其表面粗糖，然后用清水沖洗干凈，將其風(fēng)干后，使用 二甲苯試劑沖刷PVC板表面，放置于通風(fēng)楓中至二甲苯揮干。
[0064] 2)油漆的制備：防污漆（抗污損涂料）配方由基料（1.Og松香和2. 5g丙締酸樹(shù) 月旨，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、顏料（1. 5g二氧化鐵，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有 限公司）、助劑化Og膨潤(rùn)±，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、防污劑（0. 4/0. 8/1. 2g DIM或Sea-Nine2?Γ)和溶劑（10血二甲苯）五部分構(gòu)成。將固體材料依次加入不誘鋼 圓柱形容器中，然后將向容器中加入溶劑二甲苯，調(diào)整落地式高速分散機(jī)（東競(jìng)市大嶺山 金億成機(jī)械廠）主軸升降，使其攬拌軸葉輪置于溶劑水平面W下，開(kāi)始攬拌分散（轉(zhuǎn)速為 lOOOr/分鐘），使固體材料分散溶于二甲苯中，分散1小時(shí)左右，得到顆粒較粗的初級(jí)防污 漆。隨后，將粗顆粒的防污漆倒入錐形磨（北京杰瑞恒達(dá)科技有限公司）凹磨內(nèi)進(jìn)行研 磨，研磨后的防污漆被刮集到接漆板上并沿此板流出來(lái)，此時(shí)在盤(pán)上放一玻璃杯盛放流出 來(lái)的防污漆，研磨過(guò)程中，凹磨與凸磨之間的間隙保持在0. 05 - 0. 07mm，轉(zhuǎn)速設(shè)置為18化/ 分鐘，將防污漆反復(fù)研磨五次可得到粒徑小于25μπι的防污漆材料。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，設(shè)置 W下3個(gè)組：（1)陰性對(duì)照組：為不添加任何防污劑的油漆，被稱(chēng)為底漆；似陽(yáng)性對(duì)照組： 含Sea-Nine211?(w/w5%、10%和 15%)的防污漆；（3)實(shí)驗(yàn)組：含DIM(w/w5%、10%和 15%)的防污漆。
[0065] 3)刷漆涂板：在已準(zhǔn)備好的PVC板上均勻涂刷底漆和防污漆（W下統(tǒng)稱(chēng)為"油 漆")。每層油漆涂完后，將PVC板涂層置于通風(fēng)楓中使其完全風(fēng)干，再涂刷另一層油漆。漆 膜厚度分別為20μm(30-40mL)底漆，120μmX2 (400-500mL)防污漆。將涂有油漆的PVC板 置于室溫下充分驚干，為進(jìn)行野外掛板實(shí)驗(yàn)待用。
[0066] 將涂有油漆的PVC板用臘絕繩子捆綁在香港西貢碼頭（22° 38'N，114° 27'巧 橋墳上，使其浸泡在淺海中。定期觀察掛板上海洋污損生物附著品種附著量及繁殖程度，拍 照記錄污損情況，同時(shí)注意比較實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，根據(jù)觀察的結(jié)果評(píng)定防 污漆的防污性能。在本實(shí)驗(yàn)中，海區(qū)野外掛板始于海洋生物生長(zhǎng)旺盛的4月份，持續(xù)5個(gè)月。 涂布不同油漆的實(shí)驗(yàn)掛板各制備3塊，同一測(cè)試系列的掛板固定在同一框架上同一浸海深 度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。
[0067]PVC板污損面積的計(jì)算-將拍攝的記錄PVC板污損情況的照片（每周拍攝，持 續(xù)5個(gè)月）使用生物統(tǒng)計(jì)軟件ImageJ進(jìn)行處理。ImageJ是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（化tional InstitutesofHealth,NIH)開(kāi)發(fā)的，基于java的公共圖像處理軟件。由于附著在板上的 污損生物具有不同的灰度，在計(jì)算污損面積時(shí)，首先按照文獻(xiàn)"Zhu等（2010)"描述的方法， 設(shè)定一個(gè)闊值將圖片中符合闊值條件的圖像（污損生物）標(biāo)記為灰色，然后軟件會(huì)計(jì)算出 灰色部分面積，最終計(jì)算出該部分面積占PVC板總面積的百分比，也就是污損生物面積占 PVC板總面積的百分比。
[0068] 數(shù)據(jù)處理-數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。在抗污損活性測(cè)試和幼 蟲(chóng)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，EC50和LC50用Probit軟件計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的顯著性差異 (Si即ificanceDifference,SD)通過(guò)單因素AN0VA判定，并進(jìn)行^Tukey檢驗(yàn)。p-value小 于0. 05代表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間有顯著差異，小于0. 01則表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間有極顯著差異。
[0069] 例1-菌株反硝化假弧菌化denit;rificans)UST4-50次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu) 和抗污損活性
[0070] 在本研究中，已得到的乙酸乙醋粗浸膏采用反相柱進(jìn)行初步分離，得到中等極性 組分。依據(jù)紫外吸收譜圖及化rlich試劑顯色反應(yīng)，初步判斷該段組分中的化合物為日引噪 類(lèi)（Velurietal.，2003)。采用抗污損活性追蹤的方法對(duì)中等極性組分進(jìn)行了進(jìn)一步分離 純化，最終得到8個(gè)已知的雙嗎I噪生物堿類(lèi)化合物。將化合物1-8的NMR譜圖與相關(guān)文獻(xiàn) 報(bào)道度ellatal.1994;Velurietal.2003;Royetal.2014)的相關(guān)化合物（標(biāo)準(zhǔn)DIM) 譜圖對(duì)比，最終將化合物1-8分別確定為二（IH-日引噪-3-基）甲燒值IM) (1);vibrindole A(2) ;3, 3'-二-IH-嗎I噪-3-基-1,2-丙二醇（3);二（IH-嗎I噪-3-基）甲燒（4) ;1,2, 2-二 (1H-日引噪-3-基）乙酬巧）；arsindolineA(6) ;3,3'-(苯基亞甲基）雙-1H-日引噪（7); 4-(二（1H-嗎I噪-3-基）甲基）苯酪（DIM-Ph-4-OH)做（圖 1)。
[007?；衔? - 8W二（1H-嗎I噪-3-基）甲燒為母核。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，雙嗎I噪生 物堿類(lèi)的代表化合物二（1H-嗎I噪-3-基）甲燒值IM)是十字花科蔬菜中的二嗎I噪-3-甲 醇（diindole-3-carbinol，I3C)的酸性縮合產(chǎn)物，該化合物及其同系物被Bell等（1994) 首次從海洋生物硬鱗魚(yú)粒突箱鈍（Ostracioncubicus)中分離出來(lái)。后來(lái)研究者又從海洋 細(xì)菌副溶血弧菌（Vibriopar址aemolyticus)Bio249(Velu;rietal.,2003)和氣單胞菌 (Aeromonassp. )CB101(Caietal.,2010)的發(fā)酵液中分離得到了DIM的一系列同系物。 本研究首次從假弧菌（Pseudovibrio)屬細(xì)菌中分離得到雙嗎I噪甲燒類(lèi)化合物。
[0072] 雙嗎I噪生物堿類(lèi)具有多種生物活性，抗腫瘤活性尤為突出，目前該類(lèi)化合物作為 一種高效的抗癌藥物的作用機(jī)制被人們廣泛研究（ClarkandLee, 2014)。該類(lèi)化合物可 W介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期中的Akt-NFkB信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞調(diào)亡蛋白酶（caspase)的激活、細(xì)胞 周期蛋白依賴(lài)性激酶的激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，也可W通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素代謝來(lái)發(fā)揮抗腫瘤活性 度anerjeeetal.2011;Wengetal.2008)?；衔顳IM在乳腺癌的治療中發(fā)揮著重要作 用，主要通過(guò)激活芳基-控受體（AhR)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞分化 化alletal. 2010)。此外，雙嗎I噪生物堿類(lèi)化合物還表現(xiàn)出抗菌、抗炎、抗氧化和抗利什曼 蟲(chóng)等活性化imetal. 2014;Royetal. 2014)。
[0073] 本發(fā)明中首次報(bào)道了雙嗎I噪生物堿類(lèi)化合物1 - 8的抗污損活性（表1)。對(duì)化合物 1-8進(jìn)行了抗紋藤壺化amphitrite)幼蟲(chóng)附著活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，除了碳鏈含有兩個(gè)醇徑基的 化合物3外，所有化合物均表現(xiàn)出低毒、高效的抗污損活性（表1)。高的LCsa/ECs。比表明運(yùn) 些化合物表現(xiàn)出好的抗紋藤壺幼蟲(chóng)附著活性，同時(shí)無(wú)致死效果。因此，認(rèn)為DIM及其類(lèi)似物 為無(wú)毒的抗污劑。其中，化合物UECs〇= 3. 27μM，LC5〇/ECs。巧3)和7巧Cs〇= 3. 57μM，LC5。/ ECsoM。的抗紋藤壺幼蟲(chóng)附著活性與商品防污劑Sea-Nine21Γ巧Cs。= 3. 35μΜ,LC5。/ ECsc= 15. 86)相當(dāng)，但是其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照試劑Sea-Nine211 ?;化合物8(EC5。= 1. 86μΜ，LC5e/EC5D〉70)的抗污損活性是Sea-Nine211?活性的兩倍，同時(shí)無(wú)毒。除抗紋藤壺 幼蟲(chóng)附著活性測(cè)試外，我們還對(duì)化合物1和8進(jìn)行了抗苔薛蟲(chóng)幼蟲(chóng)附著活性篩選，結(jié)果如表 2所示，運(yùn)兩個(gè)化合物顯示出了較強(qiáng)的抑制苔薛蟲(chóng)幼蟲(chóng)附著的作用，ECw值分別為2. 54和 1. 25yM，LC5〇/ECs。均大于 50,其活性是陽(yáng)性對(duì)照藥物Sea-Nine211TM巧Cs〇= 8. 51μΜ，LCs。/ ECs〇= 8. 33)的4-7倍，毒性卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Sea-Nine211ΤΜ。
[0074] 高效、低毒的防污劑絕不是在抗污損過(guò)程中通過(guò)其強(qiáng)烈的致死毒性來(lái)發(fā)揮防污 活性，而是在移除防污劑后，原來(lái)暴露在防污劑下的幼蟲(chóng)可W重新復(fù)蘇并仍然能夠正常生 長(zhǎng)發(fā)育至附著變態(tài)。為了進(jìn)一步研究本發(fā)明的雙嗎I噪生物堿類(lèi)物質(zhì)的抗污損作用，對(duì)DIM 和DIM-Ph-4-OH進(jìn)行了紋藤壺幼蟲(chóng)復(fù)蘇效果測(cè)試，W檢測(cè)暴露在DIM及其類(lèi)似物之后的游 動(dòng)幼蟲(chóng)是否能夠在新鮮海水中正常附著和變態(tài)。如圖2所示，經(jīng)過(guò)DIM(25. 39μM) (50μg 血1)和DIM-Ph-4-0H(73. 93μΜ)(lOOyg血1)處理24小時(shí)的藤壺幼蟲(chóng)，將其轉(zhuǎn)移至FSW中，48小時(shí)后，分別有93%和95%的幼蟲(chóng)可W復(fù)蘇，并且能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育至附著變態(tài)，其 幼蟲(chóng)附著率和陰性對(duì)照組相當(dāng)，運(yùn)一實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明了雙嗎I噪生物堿化合物并不是通過(guò) 簡(jiǎn)單的對(duì)幼蟲(chóng)致死毒性發(fā)揮其防污作用，該類(lèi)化合物具有獨(dú)特的低毒、可逆的抗污損作用 機(jī)制，在完全抑制幼蟲(chóng)附著的濃度下對(duì)祀向生物無(wú)毒。
[00巧]表1.化合物l-8a和嗎I噪的抗紋藤壺度alarmsamphitrite)幼蟲(chóng)附著活性
[0076]
[0077]數(shù)據(jù)=平均值 ±SD(n= 3)，卸<0. 05 ;**p<0. 01(單因素AN0VA)
[0078] 例2-構(gòu)效關(guān)系討論
[0079] 本研究中菌株UST4-50來(lái)源的所有雙嗎I噪生物堿類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物均顯現(xiàn)出低毒、 高效的抗紋藤壺幼蟲(chóng)附著活性。因此，我們推測(cè)雙嗎I噪亞甲基（二（1H-嗎I噪-3-基）亞甲 基）可能是維持該類(lèi)化合物低毒高效抗污損作用的基本結(jié)構(gòu)。根據(jù)嗎I噪生物堿類(lèi)防污化合 物的報(bào)道化awamataetal，2006)，蘆竹堿類(lèi)抗污損化合物最明顯的分子結(jié)構(gòu)特征為均具 有單嗎I噪環(huán)。因此，在本研究中對(duì)嗎I噪的抗紋藤壺幼蟲(chóng)附著的活性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗎I 噪的抗紋藤壺和苔薛蟲(chóng)幼蟲(chóng)附著的ECs。值分別為17. 50μΜ和127. 6μM，其抗污損活性遠(yuǎn)遠(yuǎn) 低于嗎I噪二聚物DIM巧Cs。值分別為3. 27和2. 54μΜ)。同時(shí)，嗎I噪的毒性卻是該化合物的 10倍左右（參見(jiàn)表1和表2)。更為重要的是，嗎I噪Ξ聚物Ξ(1Η-嗎I噪-3-基）甲燒（4) 的抗紋藤壺幼蟲(chóng)附著活性巧Csa= 5. 81μΜ)并沒(méi)有隨著嗎I噪環(huán)的低聚而增強(qiáng)，化合物4的 抗污損活性仍低于嗎I噪二聚物，運(yùn)種低聚物的抗污損活性并沒(méi)有隨著單體聚合的增多而增 強(qiáng)的現(xiàn)象在化imali等（2003)的相關(guān)防污劑研究中也曾報(bào)道。綜上所述，通過(guò)對(duì)嗎I噪、嗎I 噪二聚物和Ξ聚物的抗污損活性比較發(fā)現(xiàn)，嗎I噪二聚物DIM的抗污損作用最為突出。運(yùn)進(jìn) 一步證實(shí)了雙嗎I噪亞甲基對(duì)于維持雙嗎I噪生物堿類(lèi)化合物的低毒、高效抗污損活性的重要 貢獻(xiàn)，同時(shí)也說(shuō)明了雙嗎I噪生物堿抗污損作用機(jī)制可能與嗎I噪不同。
[0080] 比較化合物1-8的抗污損活性發(fā)現(xiàn)，DIM-Ph-4-OH具有最強(qiáng)的抗紋藤壺幼蟲(chóng)附著 活性巧Csa= 1. 86μΜ)，同時(shí)也表現(xiàn)出了優(yōu)秀的抗苔薛蟲(chóng)幼蟲(chóng)附著活性巧Csa= 1. 25μΜ)。 與其他化合物相比較，化合物8最明顯的結(jié)構(gòu)特征為具有化-Cl"'酪徑基，那么苯環(huán)對(duì)位