本發(fā)明涉及飼料原料及加工工藝技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種模擬動物胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法。
背景技術(shù)：
磷是畜禽日糧中僅次于能量、蛋白質(zhì)及鈣的重要營養(yǎng)物質(zhì)，是動物體生長發(fā)育所必需的常量礦物質(zhì)元素，參與體內(nèi)許多生理功能和生物化學(xué)反應(yīng)。常用植物性飼料中60％-70％的磷是以植酸或者植酸鹽的有機磷形式存在，反芻動物瘤胃微生物可以產(chǎn)生大量的植酸酶，可以很好地利用植酸磷，而單胃動物對植酸磷的利用效率很低，食入的磷有75％都隨糞便排出，需要通過在飼料中添加磷酸氫鈣等無機磷的形式進行補充，不僅增加成本，還會造成環(huán)境污染。
植酸酶在動物胃中可以將植酸磷釋放，提高植物性飼料中磷的利用效率，減少外源磷的使用量，節(jié)省成本，并減少環(huán)境污染。另外，植酸往往還會和其他養(yǎng)分(如鋅、鐵等)以絡(luò)合物的形式存在，不易解離，使用植酸酶可以提高此部分養(yǎng)分的使用效率?，F(xiàn)在，隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，飼料用植酸酶制劑的應(yīng)用也越來越廣泛，不同公司采用不同的生產(chǎn)菌種、基因來源生產(chǎn)植酸酶，其使用方式及活性評定方法各有差異，因此在畜禽生產(chǎn)中無法客觀的評定植酸酶的使用效果。植酸酶是一種蛋白質(zhì)，進入動物胃中會被胃蛋白酶降解，飼料中植酸酶在胃中的有效利用率及有效解磷含量是個未知數(shù)，目前還沒有人測定過。因此，通過體外模擬胃環(huán)境來測定植酸酶的有效解磷含量，對于快速評定植酸酶質(zhì)量，選擇質(zhì)佳的植酸酶是極為重要的。
植物性飼料中的磷通常是以植酸磷形式存在，植酸磷很難被單胃動物利用，因此，植物性飼料中總磷的消化利用率很低，需要外源補充磷。植酸酶在動物胃中可以將植酸磷釋放，提高植物性飼料中磷的利用效率，減少外源磷的使用量，節(jié)省成本，并減少環(huán)境污染。
植酸往往還會和其他養(yǎng)分(如鋅、鐵等)以絡(luò)合物的形式存在，不易解離，使用植酸酶可以提高此部分養(yǎng)分的使用效率。再者，有證據(jù)表明，NSP酶等外源酶作用的發(fā)揮效果有賴于植酸酶的支持；在沒有使用植酸酶的情況下，NSP酶作用效果不佳。故而，選擇質(zhì)佳的植酸酶對于提高飼糧質(zhì)量是極為重要的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種模擬動物胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法，通過底物多釋放水溶性磷的多寡來判定植酸酶的作用大小，進而選擇質(zhì)佳的植酸酶，有效減少外源磷的使用量。
為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種模擬動物胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法，包括以下步驟：首先將底物各原料混合后粉碎，所述底物是由以下原料按照質(zhì)量百分比組成：玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS 10％，添加待測植酸酶與所述底物混合，同時作空白對照，分別加入到胃蛋白酶鹽酸溶液中，40℃恒溫水浴，冷卻至室溫后再測定溶液pH，準(zhǔn)確移取12mL上清液至離心管中，并準(zhǔn)確量取剩余上清液，將離心管中的上清液離心，得上清液A，再準(zhǔn)確移取離心管中上清液A 1mL，加入釩鉬酸胺顯色劑，再加蒸餾水定容，搖勻靜置，用分光光度計比色測定，最后從磷標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得磷的濃度,計算在模擬胃環(huán)境中添加植酸酶飼料底物多釋放的水溶性磷含量。
一種模擬動物胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法，其具體實現(xiàn)步驟如下：
(1)首先制備底物：所述底物由如下原料按照質(zhì)量百分比組成:玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS 10％；按照上述配比稱取各原料混合后粉碎，并過40目篩；
(2)分別稱取3～7g所述步驟(1)制備的底物，各置于250mL碘量瓶中,按1000FYT/kg的酶活添加量添加0.1～1mg的待測植酸酶加入到其中一個碘量瓶中，同時平行做空白對照(底物中不加入待測植酸酶)；
(3)然后將100mL胃蛋白酶鹽酸溶液緩慢加入至碘量瓶中制成消化液，緩慢攪拌后測定消化液的pH，當(dāng)pH大于3.5，用pH 2.0的鹽酸溶液將消化液調(diào)整至3.0～3.5之間，嚴(yán)密封口，所述鹽酸溶液為取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36％的濃鹽酸0.83mL，定容至1000mL；
(4)40℃恒溫水浴搖床2h，冷卻至室溫后再測定溶液pH，pH應(yīng)保持在4.0～4.5之間；
(5)準(zhǔn)確移取12mL碘量瓶中的上清液至離心管中，同時，準(zhǔn)確量取碘量瓶中剩余上清液的體積，將上清液4000rpm離心10min，得上清液A；
(6)準(zhǔn)確移取離心管中1mL上清液A至50mL比色管中，加入10mL釩鉬酸胺顯色劑，加蒸餾水定容至50mL，搖勻靜置10min；
(7)用分光光度計400nm比色測定，從磷標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得磷的濃度(待測植酸酶磷濃度C1和空白對照磷濃度C2)；
(8)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分別置于50mL容量瓶中，分別加入釩鉬酸銨顯色劑10mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置10min，在400nm波長下用分光光度計測各溶液的吸光度，以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(9)計算在模擬胃環(huán)境中添加植酸酶飼料底物多釋放的水溶性磷含量p，公式為：
其中，C1：待測植酸酶磷濃度(μg/mL)；C2：空白對照磷濃度(μg/mL)；v1：添加待測植酸酶碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；V2：空白對照碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；m：底物樣品重量(g)。
進一步地，所述步驟的植酸酶為非耐高溫型，固態(tài)顆粒狀，酶活為5000～50000FYT/g。
進一步地，所述胃蛋白酶鹽酸溶液：將胃蛋白酶與鹽酸溶液混合，混合后pH為2.0，胃蛋白酶的質(zhì)量百分比濃度為0.2％，所述鹽酸溶液為取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36％的濃鹽酸0.83mL，定容至1000mL，pH為2.0。
進一步地，所述釩鉬酸胺顯色劑的配制具體步驟為：稱取偏釩酸銨1.25g，加水200mL，加熱溶解不能沸騰，冷卻后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65％的濃硝酸250mL溶解制成溶液A；另外稱取鉬酸銨25g，加水400mL加熱溶解，冷卻，制成溶液B，將溶液A和溶液B混合，定容至1000mL。
進一步地，所述磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制具體步驟為：取105℃烘至恒重的磷酸二氫鉀0.2195g溶于蒸餾水中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65％的濃硝酸3mL，定容至1000mL。
進一步地，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明提供的模擬胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法，在模擬胃環(huán)境條件下測定底物釋放水溶性磷含量，通過底物釋放水溶性磷的多寡來判定植酸酶的作用大小，選擇質(zhì)佳的植酸酶，提高植物性飼料中磷的利用效率，減少外源磷的使用量，節(jié)省成本，并減少環(huán)境污染。
植酸磷是一個含六個磷酸基團的環(huán)狀化合物，在大多數(shù)油籽和豆科植物中占干物質(zhì)的1％-5％。通常將植酸磷列入抗?fàn)I養(yǎng)因子，因為它不僅與植物中40％-70％的磷結(jié)合，而且植酸磷還與其它二價和三價金屬元素如鈣、鎂、鋅和鐵等金屬離子螯合形成極難溶解的化合物，動物很難吸收。反芻動物瘤胃微生物產(chǎn)生大量的植酸酶，可以很好地利用植酸磷，而單胃動物對植酸磷的利用效率很低，食入的磷有75％都隨糞便排出，需要通過在飼料中添加磷酸氫鈣等無機磷的形式進行補充。
植酸酶是一類特殊的磷酸單酯酶，對植酸磷的降解率有一個很寬的pH范圍,有研究表明，植酸酶在酸性條件下活性較強，主要在胃中發(fā)揮作用。植酸酶在胃中可有效分解存在于飼料中的植酸，將植酸和植酸鹽中的磷酸基團逐一水解,最終釋放出肌醇和無機磷，提高植酸磷的利用率，同時由于解除了植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用,可以提高單胃動物對淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的利用率,并且釋放被植酸鰲合的各種礦物元素,促進了動物礦質(zhì)營養(yǎng)的平衡,改善動物的組織結(jié)構(gòu)，促進動物生長。
植酸酶是一種蛋白質(zhì)，進入胃中會被胃蛋白酶降解，無法準(zhǔn)確估測植酸酶的有效利用率，因此通過模擬胃環(huán)境，在體外條件下測定底物釋放水溶性磷含量，通過底物釋放水溶性磷的多寡來判定植酸酶的有效利用率，對于選擇質(zhì)佳的植酸酶具有重要的意義。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體附圖及實施例進一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明實施例中的試驗試材：
1、試驗材料：植酸酶，非耐高溫型，固態(tài)顆粒狀，酶活為5000～50000FYT/g。
2、試驗試劑和藥品。
(1)胃蛋白酶鹽酸溶液：將胃蛋白酶與鹽酸溶液混合，混合后pH為2.0，胃蛋白酶的質(zhì)量百分比濃度為0.2％。配制時需小心緩慢攪拌，防止胃蛋白酶失活。
(2)釩鉬酸胺顯色劑：稱取偏釩酸銨1.25g，加水200mL，加熱溶解(不能沸騰)，冷卻后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65％的濃硝酸250mL溶解制成溶液A；稱取鉬酸銨25g，加水400mL加熱溶解，冷卻后制成溶液B，將溶液A與溶液B混合，定容至1000mL。
(3)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液：將105℃烘至恒重的磷酸二氫鉀0.2195g溶于蒸餾水中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65％的濃硝酸3mL，定容至1000mL。
(4)鹽酸溶液：0.83mL的濃鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36％)，定容至1000mL，pH為2.0。
(5)底物：由如下原料按照質(zhì)量百分比組成:玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS 10％。
3、儀器：恒溫水浴搖床(SHZ-A，上海浦東物理光學(xué)儀器廠)，低速離心機(LD5-2B，雷勃爾)，可見分光光度計(721，上海菁華科技儀器有限公司)。
實施例1
一種模擬動物胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法，其具體實現(xiàn)步驟如下：
(1)按照底物上述配比稱取底物各組分,將底物原料分別粉碎混合后全部通過40目篩，分別稱取5g(準(zhǔn)確至0.0001g)(m)，各置入250mL碘量瓶中；
(2)按1000FYT/kg的酶活添加量，取5000FYT/g的1mg(精準(zhǔn)至0.1mg)某廠家待測植酸酶加入到其中一個碘量瓶中，同時平行做空白對照(底物中不添加待測植酸酶)；
(3)向碘量瓶中緩慢加入胃蛋白酶鹽酸溶液100mL制成消化液，緩慢攪拌后測定消化液的pH，若發(fā)現(xiàn)pH大于3.5，應(yīng)用pH 2.0的鹽酸溶液將消化液調(diào)整至3.0～3.5之間，嚴(yán)密封口；
(4)將嚴(yán)密封口的碘量瓶放入提前預(yù)熱的恒溫水浴搖床，40℃水浴2h；
(5)水浴結(jié)束后將碘量瓶冷卻至室溫，測定溶液pH；一般情況下，pH在4.0～4.5之間。若超過此范圍，則此次測定失敗，需重新測定；
(6)準(zhǔn)確移取碘量瓶中的上清液12mL，轉(zhuǎn)移至15mL的離心管中。同時，準(zhǔn)確量取碘量瓶中剩余上清液的體積；
(7)將離心管置于離心機中，平衡后4000rpm離心10min，得上清液A；
(8)準(zhǔn)確移取1mL離心管中的上清液A至50mL比色管中，加入10mL釩鉬酸胺顯色劑，加蒸餾水定容至50mL，搖勻靜置10min；
(9)用分光光度計400nm比色測定，從磷標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得磷的濃度(C1和C2)；
(10)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分別置于6個50mL容量瓶中，分別加入釩鉬酸銨顯色劑10mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置10min，在400nm波長下用分光光度計測各溶液的吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示；
(11)結(jié)果計算
在模擬胃環(huán)境中添加植酸酶飼料底物多釋放的水溶性磷含量(P)，公式為：
其中，C1：待測植酸酶磷濃度(μg/mL)；C2：空白對照磷濃度(μg/mL)；v1：添加待測植酸酶碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；V2：空白對照碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；m：底物樣品重量(g)；
(12)試驗結(jié)果
試驗結(jié)果如表1所示，表明待測植酸酶能明顯提高水溶性磷的釋放量。
表1植酸酶解磷含量測定結(jié)果
實施例2
一種模擬動物胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法，其具體實現(xiàn)步驟如下：
(1)按照底物上述配比稱取底物各組分,將底物原料分別粉碎混合后全部通過40目篩，分別稱取3g(準(zhǔn)確至0.0001g)(m)，各置入250mL碘量瓶中；
(2)按1000FYT/kg的酶活添加量，取10000FYT/g的0.3mg(精準(zhǔn)至0.1mg)某廠家待測植酸酶加入到其中一個碘量瓶中，同時平行做空白對照(底物中不加入待測植酸酶)；
(3)向碘量瓶中緩慢加入胃蛋白酶鹽酸溶液100mL，緩慢攪拌后測定消化液的pH，若發(fā)現(xiàn)pH大于3.5，應(yīng)用pH 2.0的鹽酸溶液將消化液調(diào)整至3.0～3.5之間，嚴(yán)密封口；
(4)將嚴(yán)密封口的碘量瓶放入提前預(yù)熱的恒溫水浴搖床，40℃水浴2h；
(5)水浴結(jié)束后將碘量瓶冷卻至室溫，測定溶液pH；一般情況下，pH在4.0～4.5之間；若超過此范圍，則此次測定失敗，需重新測定；
(6)準(zhǔn)確移取碘量瓶中的上清液12mL，轉(zhuǎn)移至15mL的離心管中。同時，準(zhǔn)確量取碘量瓶中剩余上清液的體積；
(7)將離心管置于離心機中，平衡后4000rpm離心10min，得上清液A；
(8)準(zhǔn)確移取1mL離心管中的上清液A至50mL比色管中，加入10mL釩鉬酸胺顯色劑，加蒸餾水定容至50mL，搖勻靜置10min；
(9)用分光光度計400nm比色測定，從磷標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得磷的濃度(C1和C2)。
(10)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分別置于6個50mL容量瓶中，分別加入釩鉬酸銨顯色劑10mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置10min，在400nm波長下用分光光度計測各溶液的吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示；
(11)結(jié)果計算
在模擬胃環(huán)境中添加植酸酶底物多釋放的水溶性磷含量(P)，公式為：
其中，C1：待測植酸酶磷濃度(μg/mL)；C2：空白對照磷濃度(μg/mL)；v1：待測植酸酶碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；V2：空白對照碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；m：底物樣品重量(g)；
(12)試驗結(jié)果
試驗結(jié)果如表2所示，表明待測植酸酶能明顯提高水溶性磷的釋放量。
表2植酸酶解磷含量測定結(jié)果
實施例3
一種模擬動物胃環(huán)境內(nèi)植酸酶解磷含量測定方法，其具體實現(xiàn)步驟如下：
(1)按照底物上述配比稱取底物各組分,將底物原料分別粉碎混合后全部通過40目篩，分別稱取7g(準(zhǔn)確至0.0001g)(m)，各置入250mL碘量瓶中；
(2)按1000FYT/kg的酶活添加量，取50000FYT/g的0.14mg(精準(zhǔn)至0.1mg)待測植酸酶加入到其中一個碘量瓶中，同時平行做空白對照(底物中不添加待測植酸酶)；
(3)向碘量瓶中緩慢加入胃蛋白酶鹽酸溶液100mL，緩慢攪拌后測定消化液的pH，若發(fā)現(xiàn)pH大于3.5，應(yīng)用pH 2.0的鹽酸溶液將消化液調(diào)整至3.0～3.5之間，嚴(yán)密封口。
(4)將嚴(yán)密封口的碘量瓶放入提前預(yù)熱的恒溫水浴搖床，40℃水浴2h；
(5)水浴結(jié)束后將碘量瓶冷卻至室溫，測定溶液pH；一般情況下，pH在4.0～4.5之間；若超過此范圍，則此次測定失敗，需重新測定；
(6)準(zhǔn)確移取12mL碘量瓶中的上清液，轉(zhuǎn)移至15mL的離心管中。同時，準(zhǔn)確量取碘量瓶中剩余上清液的體積；
(7)將離心管置于離心機中，平衡后4000rpm離心10min，得上清液A；
(8)準(zhǔn)確移取1mL離心管中的上清液A至50mL比色管中，加入10mL釩鉬酸胺顯色劑，加蒸餾水定容至50mL，搖勻靜置10min；
(9)用分光光度計400nm比色測定，從磷標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得磷的濃度(C1和C2)；
(10)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分別置于6個50mL容量瓶中，分別加入釩鉬酸銨顯色劑10mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置10min，在400nm波長下用分光光度計測各溶液的吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示；
(11)結(jié)果計算
在模擬胃環(huán)境中添加植酸酶底物多釋放的水溶性磷含量(P)，公式為：
其中，C1：待測植酸酶磷濃度(μg/mL)；C2：空白對照磷濃度(μg/mL)；v1：添加待測植酸酶碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；V2：空白對照碘量瓶中剩余上清液的體積(mL)；m：底物樣品重量(g)；
(12)試驗結(jié)果
試驗結(jié)果如表3所示，表明待測植酸酶能明顯提高水溶性磷的釋放量。
表3植酸酶解磷含量測定結(jié)果
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。