本發(fā)明涉及化學(xué)品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種測(cè)定度骨化醇及其所含雜質(zhì)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
度骨化醇(Doxercalciferol)又稱1-A羥基維生素D2，是一種維生素D2類似物主要作用于甲狀旁腺，能夠有效抑制全段甲狀旁腺激素的分泌，較小程度增加血鈣和血磷濃度，為FDA批準(zhǔn)用于骨質(zhì)疏松癥、3到4級(jí)慢性腎病患者的SHPT等新藥。度骨化醇的分子式為：C28H44O2，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：
在度骨化醇合成過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一些相關(guān)的雜質(zhì)物質(zhì)如生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物或中間體或降解產(chǎn)物等。這些雜質(zhì)可能會(huì)由于去除不完全而影響藥物的純度和質(zhì)量。目前，已知的雜質(zhì)有3種，分別為：有關(guān)物質(zhì)1、有關(guān)物質(zhì)2、有關(guān)物質(zhì)3。上述三種雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：
對(duì)于在度骨化醇合成工藝中引入的上述雜質(zhì)(或者稱之為“副產(chǎn)物、中間體和相關(guān)的降解雜質(zhì)”)都需要在度骨化醇原料及制劑中進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，實(shí)現(xiàn)對(duì)度骨化醇中雜質(zhì)的分離和測(cè)定，對(duì)度骨化醇原料及制劑的生產(chǎn)和貯存具有重要的意義。
目前對(duì)于度骨化醇有關(guān)物質(zhì)的分析檢測(cè)方法有李靖，季金茍?jiān)凇禖hinese Journal of Analysis Laboratory》第28卷第11期中報(bào)導(dǎo)過(guò)。其采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.7ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣體積為5μL。該方法的平均回收率和中間精密度均較高。但是，該文獻(xiàn)并沒(méi)有描述該方法對(duì)上述相關(guān)雜質(zhì)的分離檢測(cè)能力，且在該方法下主峰的相對(duì)保留時(shí)間較長(zhǎng)。
另外，Ninus Simonzadeh等人在《Determination of Degradation Products of Doxercalciferol by Solid-Phase Extraction and Reversed-Phase HPLC》一文中報(bào)導(dǎo)過(guò)，以水和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.6ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣體積為100μL。該文獻(xiàn)對(duì)上述有關(guān)物質(zhì)1、有關(guān)物質(zhì)2、有關(guān)物質(zhì)3實(shí)現(xiàn)了分離檢測(cè)。但是該方法的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，主峰的相對(duì)保留時(shí)間較長(zhǎng)，且在274nm波長(zhǎng)處的雜質(zhì)響應(yīng)值較低，使測(cè)得的雜質(zhì)含量比實(shí)際偏低，不利于度骨化醇原料中雜質(zhì)的控制，從而最終影響到度骨化醇制劑在臨床上的治療效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于公開一種測(cè)定度骨化醇及其所含雜質(zhì)的檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)度骨化醇及其所含三種有關(guān)物質(zhì)的分離和檢測(cè)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)四種物質(zhì)的分離和檢測(cè)，提高分離和檢測(cè)的效率，并降低檢測(cè)時(shí)間和主峰的相對(duì)保留時(shí)間。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種測(cè)定度骨化醇及其所含雜質(zhì)的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法采用高效液相色譜檢測(cè)法，所述檢測(cè)方法的色譜條件為：
色譜柱：以球狀蛋白用親水硅膠或者十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；
流動(dòng)相：酸溶液與有機(jī)溶劑組成的混合溶液；
流速：1.5～2.0mL/min；
檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；
柱溫：40℃；
進(jìn)樣量：5～10uL；
樣品濃度：3～5mg/mL；
所述混合溶液中的酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比隨著高效液相色譜法的洗脫進(jìn)度梯度減低。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括采用有機(jī)溶劑溶解樣品。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述酸溶液中的酸選自磷酸、甲酸、乙酸、檸檬酸或三氟乙酸中的一種或者兩種以任意比例的混合物。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述酸溶液的濃度為0.01～0.05vol％。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述酸溶液的濃度為0.05vol％。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述有機(jī)溶劑選自甲醇或者乙腈。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述混合溶液中的酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比為：
0min，酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比為30:70；
15min，酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比為28:72；
20min，酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比為15:85；
25min，酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比為15:85；
30min，酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比為0:100。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：在本發(fā)明中，在高效液相色譜檢測(cè)法的梯度洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相中的酸溶液與有機(jī)溶劑的體積比隨著高效液相色譜法的洗脫進(jìn)度梯度減低，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)度骨化醇及其所含的三種雜質(zhì)的分離和檢測(cè)，提高了分離和檢測(cè)的效率，并降低了檢測(cè)時(shí)間和主峰的相對(duì)保留時(shí)間。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明測(cè)定度骨化醇及其所含雜質(zhì)的高效液相色譜法在對(duì)樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)所形成的色譜圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖所示的各實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，這些實(shí)施方式并非對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)這些實(shí)施方式所作的功能、方法、或者結(jié)構(gòu)上的等效變換或替代，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
除非說(shuō)明書中有特殊說(shuō)明，本發(fā)明中的各個(gè)實(shí)施例中的組分、原料均采用分析純級(jí)別。另外，各實(shí)施例中的“g”為重量單位“克”；“h”為時(shí)間單位“小時(shí)”；“ml”為體積單位“毫升”；“室溫”為23℃。“vol％”為濃度單位“體積百分比”。
一種高效液相色譜法分離測(cè)定度骨化醇及有關(guān)物質(zhì)的方法，該高效液相色譜法分析過(guò)程中采用的色譜柱是十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，以酸溶液和有機(jī)溶劑按一定比例混合為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。酸溶液中的酸選自磷酸、甲酸、乙酸、檸檬酸或三氟乙酸中的一種或者兩種以任意比例的混合物，并最優(yōu)選為三氟乙酸。有機(jī)溶劑為甲醇或者乙腈中的一種或者兩種任意比例的混合物，并最優(yōu)選為乙腈。
本發(fā)明所述的方法適用于上述的三種雜質(zhì)的分離和測(cè)定，既可用于單獨(dú)檢測(cè)某一種雜質(zhì)，也可同時(shí)分離和檢測(cè)這三種雜質(zhì)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法更快捷，提高了高效液相色譜檢測(cè)法的檢測(cè)效率。
本發(fā)明所述的方法，在一個(gè)具體實(shí)施方式中。按照以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。取度骨化醇、有關(guān)物質(zhì)1、有關(guān)物質(zhì)2、有關(guān)物質(zhì)3對(duì)照品(均為分析純級(jí)別)各適量，使用乙腈作為有機(jī)溶劑溶解，以配制成每lml含度骨化醇100μg、有關(guān)物質(zhì)1、有關(guān)物質(zhì)2及有關(guān)物質(zhì)3各1μg的系統(tǒng)適用性溶液。
取度骨化醇對(duì)照品，用乙腈溶解，配制成每lml含0.1μg的對(duì)照品溶液。
取待測(cè)樣品適量，用乙腈溶解，配制成每lml含度骨化醇100μg的供試品溶液。
分別取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液和對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。本實(shí)施例中的色譜條件如下所示。
高效液相色譜儀的型號(hào)為：Dinoex U3000 8053386。色譜柱直徑為4.6mm。色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；流動(dòng)相：酸溶液與有機(jī)溶劑組成的混合溶液；流速：1.5～2.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5～10uL；樣品濃度：3～5mg/mL；柱長(zhǎng)：150mm；十八烷基硅烷鍵合硅膠顆粒的粒徑為5μm。
以0.05vol％的三氟乙酸和乙腈所組成的混合溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫?；旌先芤褐械乃崛芤号c有機(jī)溶劑的體積比隨著高效液相色譜法的洗脫進(jìn)度梯度減低，具體請(qǐng)參表一所示。
表一
按帶校正因子的對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算供試品中各已知雜質(zhì)的含量，按對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中其他單個(gè)雜質(zhì)的含量，總雜質(zhì)為各已知雜質(zhì)與其他單個(gè)雜質(zhì)之和。
本發(fā)明的方法還可對(duì)度骨化醇降解雜質(zhì)進(jìn)行分離測(cè)定，降解待測(cè)樣品的制備如下：取度骨化醇適量，置量瓶中，用H2O2溶解，密塞，于80℃加熱20分鐘取出，用有機(jī)溶劑(例如，甲醇、乙醇或者乙醚)溶解，配制成每lml含度骨化醇100μg的供試品溶液，取5μL注入高效液相色譜儀，按照上述的色譜條件完成度骨化醇?jí)A降解雜質(zhì)的測(cè)定。取供試品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，具體請(qǐng)參圖1所示。圖1中，有關(guān)物質(zhì)1檢出峰值出現(xiàn)的時(shí)間為18.257分鐘，度骨化醇檢出峰值出現(xiàn)的時(shí)間為19.005分鐘，有關(guān)物質(zhì)2檢出峰值出現(xiàn)的時(shí)間為20.337分鐘，有關(guān)物質(zhì)3檢出峰值出現(xiàn)的時(shí)間為20.939分鐘。
上文所列出的一系列的詳細(xì)說(shuō)明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施方式的具體說(shuō)明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。