一種用于檢測(cè)黃曲霉毒素m1的方法及酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于檢測(cè)黃曲霉毒素Ml的方法及酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素是一類真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很 強(qiáng)的致癌性，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉巧W及一些與人類血液，動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。黃 曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素B1的哲基化代謝產(chǎn)物，也是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)。牛乳及其制品是易 受到黃曲霉毒素Ml污染的食品之一。Aflatoxin Ml的檢測(cè)方法有高效液相色譜法（HPLC)， 薄層層析法（TLC)等。而使用黃曲霉毒素M1ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中 黃曲霉毒素Ml殘留。目前，黃曲霉毒素Ml國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所采取的方法是薄層層析法、分光光度 計(jì)法、巧光光譜法及高效液相色譜法。近年來(lái)，我國(guó)科研工作者在黃曲霉毒素Ml檢測(cè)方面 做了大量的工作，但都主要集中在理化檢測(cè)方面，文獻(xiàn)檢索尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于黃曲霉毒素Ml的 EL ISA檢測(cè)方法的報(bào)道，鑒于此，本發(fā)明研究和建立了黃曲霉毒素Ml的直接競(jìng)爭(zhēng)化ISA檢 測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為解決目前黃曲霉毒素Ml檢測(cè)費(fèi)用比較昂貴，且不能大批量快 速檢測(cè)，不能滿足實(shí)地檢測(cè)要求的技術(shù)問(wèn)題。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml含量的方法， 包括W下步驟： 1) 用黃曲霉毒素Ml特異性抗體包被酶標(biāo)板； 2) 加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品W及酶標(biāo)記的黃曲霉毒素Ml半抗原，解育，洗漆； 3) 加入底物顯色液顯色； 4) 加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)； 5) 通過(guò)比較黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的顏色，推測(cè)出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒 素Ml含量；或者，測(cè)定各孔的吸光度，建立黃曲霉毒素Ml濃度相對(duì)于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并 根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線由待測(cè)樣品的吸光度推算出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素Ml含量。
[0005] 本發(fā)明還提供另一種檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml含量的方法，包括W下步驟；1)用 黃曲霉毒素Ml半抗原或黃曲霉毒素Ml半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物包被酶標(biāo)板； 2) 加入黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品； 3) 加入黃曲霉毒素Ml特異性抗體，解育，洗漆； 4) 加入酶標(biāo)記的抗體，解育，洗漆； 5) 加入底物顯色液顯色； 6) 加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)； 7) 通過(guò)比較黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的顏色，推測(cè)出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒 素Ml含量；或者，測(cè)定各孔的吸光度，建立黃曲霉毒素Ml濃度相對(duì)于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并 根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線由待測(cè)樣品的吸光度推算出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素Ml含量。
[0006] 進(jìn)一步地，在本發(fā)明所提供的檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml含量的方法，還可W包括 樣品前處理步驟： 當(dāng)所述樣品為牛奶時(shí)，所述樣品前處理方法為；將樣品離屯、后取下層液待測(cè)； 當(dāng)所述樣品為奶粉時(shí)，所述樣品前處理方法為；將樣品與去離子水W質(zhì)量體積比為 1 : 4-6混合均勻，離屯、后取下層液待測(cè)。
[0007] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括黃曲霉毒素Ml半 抗原和黃曲霉毒素Ml的特異性抗體；所述特異性抗體為黃曲霉毒素Ml的多克隆抗體或單 克隆抗體。
[000引進(jìn)一步地，所述黃曲霉毒素Ml半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，得到的黃曲霉毒素Ml半抗 原-載體蛋白偶聯(lián)物作為包被原，所述特異性抗體為酶標(biāo)記的；所述特異性抗體作為包被 原，所述半抗原為酶標(biāo)記的。
[0009] 進(jìn)一步地，所述黃曲霉毒素Ml半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，得到的黃曲霉毒素Ml半抗 原-載體蛋白偶聯(lián)物作為包被原；所述半抗原為酶標(biāo)記的。
[0010] 進(jìn)一步地，還包括酶標(biāo)板、黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物液、底物緩沖液、反應(yīng)終 止液、濃縮洗漆液、樣品稀釋液中的至少一種。
[001U 進(jìn)一步地，所述濃縮洗漆液為抑值為7. 2-7. 6、含有終濃度為4. 0-6. 0% (質(zhì)量） 的吐溫-20、0. 1-0. 2mol/L的磯酸鹽緩沖液，優(yōu)選地，所述濃縮洗漆液為抑值為7. 4、含有 終濃度為5% (質(zhì)量）的吐溫-20的0. Imol/L磯酸鹽緩沖液；所述反應(yīng)終止液為l-2mol/ L的硫酸溶液或2mol/L的鹽酸溶液。
[0012] 進(jìn)一步地，所述酶標(biāo)記中所用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磯酸酶； 當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述底物液為含有3, 3, 5, 5-四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二 胺的pH = 5. 0的磯酸-巧樣酸緩沖溶液，所述底物緩沖液為含有過(guò)氧化氨或過(guò)氧化脈的pH =5. 0的磯酸-巧樣酸緩沖溶液； 當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磯酸醋酶時(shí)，所述底物液為對(duì)硝基磯酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為 含有過(guò)氧化氨或氧化脈的pH = 5. 0的磯酸-巧樣酸緩沖溶液。
[0013] 進(jìn)一步地，所述黃曲霉毒素Ml半抗原或黃曲霉毒素Ml半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、 所述黃曲霉毒素Ml的特異性抗體的任意一種已包被在酶標(biāo)板上。
[0014] 本發(fā)明采用直接競(jìng)爭(zhēng)化ISA檢測(cè)模式，采用高特異性、高親合力的抗體，減少了操 作步驟，提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度；采用包被抗原進(jìn)行酶標(biāo)板的包被，相對(duì)于抗體包被， 更有利于達(dá)到較好的包被效果與較長(zhǎng)的保存時(shí)間，從而提高了試劑盒檢測(cè)的精密度與穩(wěn)定 性；另外本試劑盒利用酶標(biāo)板標(biāo)記抗體技術(shù)，且采用改良后的過(guò)艦酸鹽氧化法進(jìn)行標(biāo)記，將 酶直接標(biāo)記于黃曲霉毒素Ml特異性抗體上，將黃曲霉毒素Ml特異性抗體與酶兩種最重要 的反應(yīng)物合二為一，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良 好的活性，不僅大大簡(jiǎn)化了操作步驟和反應(yīng)時(shí)間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，而且無(wú)需 在試劑盒內(nèi)再配置抗抗體，同時(shí)也節(jié)約了黃曲霉毒素Ml特異性抗體與酶的用量，從而大大 降低了試劑盒的成本?；赪上優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明非常適用于黃曲霉毒素Ml殘留的痕量分析與 批量檢測(cè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【附圖說(shuō)明】
[00巧]圖1為黃曲霉毒素Ml的化ISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 現(xiàn)在結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。該些附圖均為簡(jiǎn)化的示意圖，僅W 示意方式說(shuō)明本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)，因此其僅顯示與本發(fā)明有關(guān)的構(gòu)成，且其不應(yīng)理解為對(duì) 本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0017] 實(shí)施例1、W黃曲霉毒素Ml半抗原為包被原的試劑盒的制備及ELISA檢測(cè)方法 一、檢測(cè)原理： 首先將黃曲霉毒素Ml抗原包被于固相載體，例如酶標(biāo)板上，然后加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣 品，再加入酶標(biāo)記黃曲霉毒素Ml抗體，包被抗原與標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素Ml競(jìng) 爭(zhēng)酶標(biāo)抗體，標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品黃曲霉毒素Ml含量高時(shí)，則與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就 少，反之結(jié)合在固相抗原上的酶標(biāo)抗體就多，反應(yīng)后加入底物液進(jìn)行顯色加W測(cè)定，當(dāng)酶標(biāo) 抗體量一定時(shí)，加入的待測(cè)樣品含黃曲霉毒素Ml越多，與固相抗原結(jié)合酶標(biāo)抗體就越少， 發(fā)色反應(yīng)減弱，百分吸光度值低，反之，則發(fā)色反應(yīng)增強(qiáng)，百分吸光度增高，因而W百分吸光 度值為縱坐標(biāo)，W黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲 線，再根據(jù)黃曲霉毒素Ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，即可推算出待測(cè)樣品中 黃曲霉毒素Ml的濃度。
[001引二、試劑盒一般可W包括： 1、包被有黃曲霉毒素Ml半抗原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)板采用96或40孔酶標(biāo)板，所用的包被 液為抑7. 4、0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，碳酸鹽緩沖溶液含l-2g碳酸鋼、2-4g碳酸氨鋼 和雙蒸水比，封閉液為抑7. 4,含有5 %山羊血清、lOg/L酪蛋白的0. 02mol/L磯酸鹽緩沖 液。
[0019] 2、酶標(biāo)記黃曲霉毒素Ml抗體工作液；采用過(guò)艦酸鹽法將酶與黃曲霉毒素Ml抗體 進(jìn)行偶聯(lián)得到的。所用標(biāo)記酶可為辣根過(guò)氧化物酶或細(xì)菌中提取的堿性磯酸醋酶，本發(fā)明 優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶，且采用改良后的過(guò)艦酸鹽氧化法進(jìn)行標(biāo)記，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省 了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良好的活性。
[0020] 3、黃曲霉毒素Ml特異性抗體工作液；可W為黃曲霉毒素Ml多克隆抗體或黃曲霉 毒素Ml單克隆抗體工作液；用稀釋液將黃曲霉毒素Ml單克隆抗體稀釋3000倍，得到特異 性抗體工作液，所述稀釋液為抑值為7. 4、0. 2mol/L的磯酸鹽緩沖液。
[0021] 4、黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，1ml/瓶，濃度分別為0 y g/mL、0. 1 y g/mL、 0. 3 y g/mL、0. 9 y g/mL、2. 7 y g/mL、8. 1 y g/mL。配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為終濃度為抑為7. 4、 0. Imol/L的磯酸鹽緩沖液。
[0022] 5、底物顯色液；底物顯色液為過(guò)氧化氨或過(guò)氧化脈、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶 液，7ml