/瓶，1瓶。
[0023] 6、終止液；2mol/L的硫酸溶液或氨氧化鋼溶液，7ml/瓶，1瓶。
[0024] 7、濃縮洗漆液；pH值為7. 4,含有在洗漆液中的終濃度為0. 03% (質(zhì)量百分含量） 疊氮化鋼、在洗漆液中的終濃度為0.05% (質(zhì)量百分含量）吐溫-20、0.02mol/L磯酸鹽緩 沖液；50ml/瓶，1瓶。
[0025] 8、樣品稀釋液；pH為7. 4,0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液，70ml/瓶，1瓶。
[0026] 實(shí)施例2、W黃曲霉毒素Ml特異性抗體為包被原、抗原為酶標(biāo)記物的試劑盒的制 備及化ISA檢測方法 一、W黃曲霉毒素Ml特異性抗體為包被原、抗原為酶標(biāo)記物的化ISA檢測原理； 當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上的包被原為黃曲霉毒素Ml特異性抗體時(shí)，向酶板微孔中加入標(biāo) 準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后，及酶標(biāo)記物，樣品中的黃曲霉毒素Ml與酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔板 上黃曲霉毒素Ml特異性抗體，洗板，顯色，樣品吸光值與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中黃曲霉毒素Ml的 含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中黃曲霉毒素Ml的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo) 板上顏色的深淺，通過與系列濃度黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣品中 黃曲霉毒素Ml的含量。
[0027] 二、W黃曲霉毒素Ml特異性抗體為包被原、抗原為酶標(biāo)記物的試劑盒一般可W包 括： 1、包被有黃曲霉毒素Ml特異性抗體的酶標(biāo)板，包被液的濃度可W為0. 15-0. 25 y g/ ml。
[002引 2、酶標(biāo)記抗原工作液；酶標(biāo)抗原為用辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素Ml抗原； 酶標(biāo)抗原的稀釋液為含有在稀釋液中的終濃度為6-8% (質(zhì)量百分含量）的山羊血清、抑 為6-8、0. 2-0. 3mol/L磯酸鹽緩沖液，酶標(biāo)抗原工作稀釋度為1 : 1000。
[0029] 3、黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0 y g/mL、0. 1 y g/mL、0. 3 y g/ 血、0. 9 y g/血、2. 7 y g/血、8. 1 y g/血。配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為終濃度為抑為7. 0-7. 5、 0. 1-0. 2mol/L的磯酸鹽緩沖液。
[0030] 4、底物顯色液；底物顯色液為過氧化氨或過氧化脈、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶 液，7ml/瓶，1瓶。
[0031] 5、終止液；l-2mol/L鹽酸或硫酸。
[0032] 6、濃縮洗漆液；抑值為7. 2-7. 6、含有在洗漆液中的終濃度為1. 0-2. 0% (質(zhì)量百 分含量）的吐溫-20、0. 1-0. 2mol/L的磯酸鹽緩沖液；40ml/瓶，1瓶。
[003引 7、樣品稀釋液；pH為7. 4,0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液，70ml/瓶，1瓶。
[0034] =、W黃曲霉毒素Ml特異性抗體為包被原、抗原為酶標(biāo)記物的試劑盒的具體組成 及其制備： (一）組成 1、包被有黃曲霉毒素Ml特異性抗體的酶標(biāo)板，包被原的濃度可W為0. 20 y g/ml。
[0035] 2、酶標(biāo)抗原工作液；酶標(biāo)抗原為用辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素Ml與載體 蛋白的偶聯(lián)物；酶標(biāo)抗原的稀釋液為含有在稀釋液中的終濃度為6% (質(zhì)量百分含量）的 山羊血清、pH為7. 4、0. 2mol/L磯酸鹽緩沖液，酶標(biāo)記抗體工作稀釋度為1 : 1000。
[0036] 3、黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0 y g/mL、l y鴻_% 3_jg/mL、3 y g/ 血、9 y g/mL、27 y g/mL、81 y g/mU配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為在配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液中終濃度為抑 為7. 2、0. Imol/L的磯酸鹽緩沖液。
[0037] 4、底物顯色液；底物顯色液為過氧化氨或過氧化脈、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶 液，7ml/瓶，1瓶。
[003引 5、終止液；2mol/L硫酸。
[0039] 6、濃縮洗漆液；抑值為7. 4,在洗漆液中的終濃度為1. 5% (質(zhì)量百分含量）吐 溫-20、0. 2mol/L磯酸鹽緩沖液；40ml/瓶，1瓶。
[0040] 7、樣品稀釋液；pH為7. 4,0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液，70ml/瓶，1瓶。
[0041] (二）制備 1、黃曲霉毒素Ml抗原的制備； a. 200mg純化的氨基黃曲霉毒素Ml加0. 3mol/L肥L 12血的比例，將純化的氨基黃曲 霉毒素Ml攬拌溶解； b. 在冰浴攬拌的條件下緩慢加入lOg/L NaN02,使氨基黃曲霉毒素Ml重氮化，同時(shí)監(jiān) 測NaN02是否過量，檢測方法；取淀粉/艦化鐘溶液滴于白色干燥玻璃片上，滴加1滴上述 重氮化溶液，混合后30s內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)黑色即完成氨基黃曲霉毒素Ml的重氮化； C.上述重氮化的氨基黃曲霉毒素Ml繼續(xù)反應(yīng)20min，稱取800mg的BSA，溶于碳酸鹽 緩沖液，制成20g/L蛋白溶液，在冰浴攬拌條件下緩慢加入重氮化氨基黃曲霉毒素Ml溶液； 邊加邊用0. Olmol/L化0H調(diào)節(jié)抑至7. 5?8. 0,獲得黃曲霉毒素Ml與牛血清白蛋白得偶 聯(lián)物，置于4°C冰箱過夜； d.于4°C條件下，先用抑值較低的稀肥L(0.01mol/L)溶液透析，然后用0. Imol/L pH7. 2的PBS透析3d，每天換透析液3次，分裝凍干后，-20°C保存。
[0042] 2、黃曲霉毒素Ml鼠單克隆抗體制備； 動(dòng)物免疫程序：采用Ba化/c小鼠作為免疫動(dòng)物，W黃曲霉毒素Ml半抗原與牛血清白蛋 白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為60 y g/只，首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混 合制成乳化劑，腹腔注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑濕合乳化，力口 強(qiáng)免疫一次，四次免疫后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
[0043] 細(xì)胞融合與克隆化；取免疫Ba化/c小鼠脾細(xì)胞，按4 ;1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞 融合，采用間接競爭酶聯(lián)免疫方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用顯微克隆法對(duì)陽性孔 進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0044] 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇；取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5X106個(gè)/mL的 細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在-70°C超低溫冰箱中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入 37 °C水浴中速融，離屯、去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0045] 單克隆抗體的制備與純化；采用體內(nèi)誘生法，將Ba化/c 8周齡的小鼠腹腔注射雜 交瘤細(xì)胞5 X 106個(gè)/只，7-10天后采集腹水。用免疫層析法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20°C 保存。
[0046] 3、辣根過氧化物酶或堿性磯酸酶的提取 1)、辣根過氧化物酶的提取 a.水提取：稱取20kg已洗干凈的鮮辣根或辣根皮，切成小塊，在粉碎機(jī)中絞碎。碎渣 漿加10kg水在低溫下攬拌浸提她，W 3000r/min分速度離屯、10分鐘，收集上清液。
[0047] b.硫酸錠分級(jí)分離；每升濾液加226g硫酸錠粉末，邊加邊攬拌，置室溫下過夜。次 日吸取上清液，再按每升上清液加258g硫酸錠粉末，隨加隨攬拌，待硫酸錠完全溶解后，置 冷室過夜。次日吸去上清液，沉淀部分在冷凍離屯、機(jī)中W 1300化/min離屯、20min，棄去上清 液，收集沉淀。將沉淀溶于200?300mL蒸饋水中，分裝于透析袋中，在流動(dòng)水中透析^2d， 直至透出的水加入氯化領(lǐng)溶液無沉淀生成為止。然后再在蒸饋水中透析她。合并透析液， 在冷凍離屯、機(jī)中W 4000r/min離屯、15min，收集上清液。
[0048] C.丙酬分級(jí)分離；將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攬拌下，用滴管沿杯 壁加入等體積預(yù)冷至-15°C的丙酬，在冷凍離屯、機(jī)中W 4000r/min離屯、15min，收集上清液， 再加入原上清液體積0.8倍的-15°C丙酬，離屯、（條件同上）收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸 饋水中，透析（方法同上）除去丙酬，即得粗HRP。
[0049] d.精制；每升粗酶液加入ImL 1M硫酸鋒溶液，在冷凍離屯、機(jī)中W 5000r/min離屯、 lOmin，收集上清液，分裝于透析袋內(nèi)，于流水中透析除硫酸鋒，約需Id,然后在蒸饋水中透 析她。將透析液合并，進(jìn)行真空干燥即得精制HRP。產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物。
[0050] 2)、堿性磯酸酶 利用產(chǎn)生堿性磯酸醋酶的EColi-317菌株發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)離屯、巧0(K)r/min， lOmin)后，沉淀的菌體經(jīng)5X10-4M邸TA-0.03M pH 8.0Tris-0. 5M庶糖高滲液處理后用 溶菌酶破壁，上清酶液經(jīng)DEAE纖維素?cái)埌栉胶拖疵?，熱處理和Se地adex G-100分子篩層 析純化。
[0化1] 4、酶標(biāo)記黃曲霉毒素Ml抗體的制備 辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記黃曲霉毒素Ml抗體的制備采用過艦酸鹽氧化法，將黃曲霉毒 素Ml抗體與辣