根過氧化物酶（HR巧采用過艦酸鋼法進(jìn)行偶聯(lián)，具體方法為： a.溶解5mg HRP于1血超純水中，加入新配置的0. Imol/L過艦酸鋼75 y L.置室溫或 4°C冰箱反應(yīng)20min或30min。
[0化2] b.反應(yīng)完后裝入透析袋，0. OOlmol/L pH4. 0醋酸緩沖溶液4°C透析過夜，按需更 換透析液。
[005引 C.將黃曲霉毒素Ml抗體用0. Imol/L碳酸緩沖液稀釋至lOmg/血，另外用0. Imol/ L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液抑調(diào)至9. 5。將0. 5mL抗體加入HRP溶液中，置室溫 或4 °C冰箱反應(yīng)化。
[0054] d.加入100 y L 4mg/mL棚氨化鋼，4°C冰箱反應(yīng)化。
[0055] e.對(duì)0. Olmol/L PBS透析過夜，加入保存液-20°C保藏備用。
[0056] 四、W黃曲霉毒素Ml特異性抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用 1、本發(fā)明提供待測(cè)樣品前處理方法為： 1)牛奶（稀釋倍數(shù)；1) 取待測(cè)樣品，700化pm室溫下離屯、，5min ; 取下層液50 待測(cè)。
[0057] 2)奶粉（稀釋倍數(shù)；5) 取1. Og奶粉，加入5ml去離子水，混勻； 7000巧m室溫下離屯、，5min ; 取下層液50 待測(cè)。
[005引 2、檢測(cè) (1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫，即20?24°C，平衡30min，將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和 樣品所用數(shù)量的條板固定于支架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按順序編號(hào)。
[0化9] (2)在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50 y L標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50uL待測(cè)樣品。然后每孔加入 50yL酶標(biāo)記物，輕搖混勻。蓋上蓋板膜，在室溫或25°C解育15min。
[0060] 做倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打，每輪洗板拍打5次，w保證 完全除去孔中的液體。用250 y L洗漆液充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復(fù)操作5 遍。
[0061] (4)每孔加入100 UL顯色液（將底物緩沖液與底物液等體積混合），輕拍混勻，蓋 上蓋板膜，暗處室溫解育15min。
[006引 （5)加入50 y L反應(yīng)終止液到微孔中，混勻，在波長(zhǎng)450nm或492nm，W空氣為空 白，測(cè)定各孔吸光值，必須在終止后立即讀取。
[0063] 檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析： W所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計(jì)算百分吸光度值，W百分吸光度值為縱坐標(biāo)，黃曲 霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。見附圖1。Y =-14. 756X+87. 767 ;R2 = 0. 9974,用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程 式求出對(duì)應(yīng)樣品的黃曲霉毒素Ml濃度。所述百分吸光度值的計(jì)算式為： 百分吸光度值（％ )=炬/Bo) X 100 其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Bo為0 y g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。
[0064] 檢測(cè)結(jié)果的分析還可W利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件進(jìn)行計(jì)算與分析，對(duì)黃曲霉毒素Ml 線性檢測(cè)范圍為0. 5?50 y g/l，檢測(cè)限為0. 5 y g/l，整個(gè)檢測(cè)過程只需35min就可W完 成。
[00化]實(shí)施例3、試劑盒精密度、準(zhǔn)確度、保存性試驗(yàn) 1、試劑盒的精密度試驗(yàn) 從3批按照實(shí)施例4 (6)中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽出10個(gè)微孔，測(cè)定9 y g/mL標(biāo) 準(zhǔn)品溶液的吸光度值（0D值），重復(fù)10次，計(jì)算變異系數(shù)CV，結(jié)果見表1。
[0066] 表1標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗(yàn)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素 Ml含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 用黃曲霉毒素 Ml特異性抗體包被酶標(biāo)板； 2) 加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品以及酶標(biāo)記的黃曲霉毒素 Ml半抗原，孵育，洗滌； 3) 加入底物顯色液顯色； 4) 加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)； 5) 通過比較黃曲霉毒素 Ml標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的顏色，推測(cè)出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒 素 Ml含量；或者，測(cè)定各孔的吸光度，建立黃曲霉毒素 Ml濃度相對(duì)于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并 根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線由待測(cè)樣品的吸光度推算出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素 Ml含量。
2. -種檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素 Ml含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 用黃曲霉毒素 Ml半抗原或黃曲霉毒素 Ml半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物包被酶標(biāo)板； 2) 加入黃曲霉毒素 Ml標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品； 3) 加入黃曲霉毒素 Ml特異性抗體，孵育，洗滌； 4) 加入酶標(biāo)記的抗體，孵育，洗滌； 5) 加入底物顯色液顯色； 6) 加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)； 7) 通過比較黃曲霉毒素 Ml標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的顏色，推測(cè)出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒 素 Ml含量；或者，測(cè)定各孔的吸光度，建立黃曲霉毒素 Ml濃度相對(duì)于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并 根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線由待測(cè)樣品的吸光度推算出待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素 Ml含量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素 Ml含量的方法，其特征在于，還 包括樣品前處理步驟，其中： 當(dāng)所述樣品為牛奶時(shí)，所述樣品前處理方法為：將樣品離心后取下層液待測(cè)； 當(dāng)所述樣品為奶粉時(shí)，所述樣品前處理方法為：將樣品與去離子水以質(zhì)量體積比為 1 : 4-6混合均勻，離心后取下層液待測(cè)。
4. 一種檢測(cè)黃曲霉毒素 Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，包括黃曲霉毒素 Ml半抗原 和黃曲霉毒素 Ml的特異性抗體；所述特異性抗體為黃曲霉毒素 Ml的多克隆抗體或單克隆 抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)黃曲霉毒素 Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于： 1) 所述黃曲霉毒素 Ml半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，得到的黃曲霉毒素 Ml半抗原-載體蛋 白偶聯(lián)物作為包被原，所述特異性抗體為酶標(biāo)記的； 2) 所述特異性抗體作為包被原，所述半抗原為酶標(biāo)記的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)黃曲霉毒素 Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于： 1) 所述黃曲霉毒素 Ml半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，得到的黃曲霉毒素 Ml半抗原-載體蛋 白偶聯(lián)物作為包被原； 2) 所述半抗原為酶標(biāo)記的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)黃曲霉毒素 Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在 于：還包括酶標(biāo)板、黃曲霉毒素 Ml標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物液、底物緩沖液、反應(yīng)終止液、濃縮洗滌 液、樣品稀釋液中的至少一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)黃曲霉毒素 Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于：所述濃 縮洗滌液為pH值為7. 2-7. 6、含有終濃度為4. 0-6. 0% (質(zhì)量）的吐溫-20、0· 1-0. 2mol/L 的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選地，所述濃縮洗滌液為pH值為7. 4、含有終濃度為5 % (質(zhì)量）的吐 溫-20的0. lmol/L磷酸鹽緩沖液；所述反應(yīng)終止液為l-2mol/L的硫酸溶液或2mol/L的鹽 酸溶液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)黃曲霉毒素 Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于：：所述 酶標(biāo)記中所用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶； 當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，所述底物液為含有3, 3, 5, 5-四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二 胺的pH = 5. 0的磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH =5. 0的磷酸-檸檬酸緩沖溶液； 當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，所述底物液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為 含有過氧化氫或氧化脲的pH = 5. 0的磷酸-檸檬酸緩沖溶液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)黃曲霉毒素 Ml的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在 于：所述黃曲霉毒素 Ml半抗原或黃曲霉毒素 Ml半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物、所述黃曲霉毒素 Ml的特異性抗體的任意一種已包被在酶標(biāo)板上。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素M1含量的方法及酶聯(lián)免疫試劑盒，采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)模式，采用高特異性、高親合力的抗體，減少了操作步驟，提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度；采用包被抗原進(jìn)行酶標(biāo)板的包被，相對(duì)于抗體包被，更有利于達(dá)到較好的包被效果與較長(zhǎng)的保存時(shí)間，從而提高了試劑盒檢測(cè)的精密度與穩(wěn)定性；另外試劑盒利用酶標(biāo)板標(biāo)記抗體技術(shù)，且采用改良后的過碘酸鹽氧化法進(jìn)行標(biāo)記，將酶直接標(biāo)記于黃曲霉毒素M1特異性抗體上，將黃曲霉毒素M1特異性抗體與酶兩種最重要的反應(yīng)物合二為一，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良好的活性，無(wú)需在試劑盒內(nèi)再配置抗體，大大降低了試劑盒的成。
【IPC分類】G01N33-577, G01N33-543
【公開號(hào)】CN104569381
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510036714
【發(fā)明人】王飛
【申請(qǐng)人】天津伯克生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月23日