置，在5000ml燒杯中加入Na2CO3H. 31g，NaHC0326 . 46g，加水 定容至4500ml，配制好的F溶液置于磁力攪拌器上備用。
[0246] 選用合適截留量（常用14000)的透析袋，量取合適的尺寸，潤濕后扎緊一端，純化 水試漏3次（需無漏液）。
[0247] 取100 μ g A I抗原-BSA蛋白連接物用0· lmol/L ρΗ9· 5的碳酸緩沖液（F溶液） 調(diào)整到Iml。放入透析液中，室溫攪拌透析2小時，將透析好的溶液加入300 μ gFITC，室溫 邊搖邊反應(yīng)24h。
[0248] 通過G-25凝膠柱純化A I抗原-BSA蛋白連接物和FITC的連接產(chǎn)物。
[0249] C2溶液的配制：加入 200ml POOl 溶液、20g BSA、8g NaN 38g、2g MgCl2 · 6H20、定容 到2000ml (過濾）。
[0250] 純化好的連接產(chǎn)物體用C2溶液對倍稀釋，即可。
[0251] ⑷A I低點(diǎn)校準(zhǔn)品、高點(diǎn)校準(zhǔn)品的制備
[0252] 將A I抗原用50 %牛血清制品按不同比例稀釋成濃度分別為16. 480ng/ml及 2. 213ng/ml兩個高、低校準(zhǔn)品定標(biāo)點(diǎn)。
[0253] (5)組裝
[0254] 將上述試劑成分分裝后組裝成試劑盒，儲存于2~8°C。
[0255] 實(shí)施例9 :利用檢測試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測A I
[0256] 使用上述實(shí)施例1-8制備好的A I檢測試劑盒和Maglumi 2000化學(xué)發(fā)光分析儀， 通過化學(xué)發(fā)光免疫競爭法來檢測樣本的A I濃度，待測樣本為160例臨床樣本。A I濃度與 相對光強(qiáng)度（Relative Light Unit，RLU)成一定的比例關(guān)系，可以使用測定儀來自動擬合 計算A I濃度。
[0257] 選取實(shí)施例1中所得的試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測的具體步驟描述如下：
[0258] 1、在樣本架上依次加載校準(zhǔn)品或待測樣本。待測樣本為經(jīng)過酶抑制劑處理后的樣 本，此樣本分為兩份，一份置于2-8°C，一份置于37°C，準(zhǔn)確計時一小時后，將兩種處理方法 的樣本置于樣本架。
[0259] 2、將樣本架插入Maglumi 2000化學(xué)發(fā)光分析儀的樣本倉，編輯樣本號開始運(yùn)行 試驗(yàn)，具體加樣步驟為：校準(zhǔn)品或待測樣本加100 μ 1，然后加示蹤標(biāo)記物標(biāo)記的A I抗原溶 液50 μ 1，加抗A I抗體包被的磁性微球懸浮液20 μ 1，混勾，37°C溫育15分鐘，儀器自動清 洗兩遍后直接進(jìn)入測量室得到各個樣本的光強(qiáng)度信號，通過十點(diǎn)曲線及兩點(diǎn)定標(biāo)自動擬合 出待測樣本的A I抗原濃度值。從而同一個樣本在兩種溫度處理下得到不同的濃度值，將 37°C處理的樣本濃度值減去2-8°C處理的樣本濃度值，即得到腎素活性（PRA)。檢測結(jié)果見 表1。
[0260] 選取實(shí)施例4中所得的試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測的具體步驟描述如下：
[0261] 1、在樣本架上依次加載校準(zhǔn)品或待測樣本。待測樣本為經(jīng)過酶抑制劑處理后的樣 本，此樣本分為兩份，一份置于2-8°C，一份置于37°C，準(zhǔn)確計時一小時后，將兩種處理方法 的樣本置于樣本架。
[0262] 2、將樣本架插入Maglumi系列化學(xué)發(fā)光分析儀的樣本倉，編輯樣本號開始運(yùn)行試 驗(yàn)，具體加樣步驟為：校準(zhǔn)品或待測樣本加100 μ 1，然后加標(biāo)記有示蹤標(biāo)記物的抗A I抗體 溶液50 μ 1，加 A I抗原標(biāo)記的FITC 50 μ 1，加抗FITC抗體包被的磁性微球懸浮液20 μ 1， 混勻，37°C溫育15分鐘，儀器自動清洗兩遍后直接進(jìn)入測量室得到各個樣本的光強(qiáng)度信 號，通過十點(diǎn)曲線及兩點(diǎn)定標(biāo)自動擬合出待測樣本的A I抗原濃度值。從而同一個樣本在 兩種溫度處理下得到不同的濃度值，將37°C處理的樣本濃度值減去2-8°C處理的樣本濃度 值，即得到腎素活性（PRA)。檢測結(jié)果見表1。
[0263] 選取實(shí)施例7中所得的試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測的具體步驟描述如下：
[0264] 1、在樣本架上依次加載校準(zhǔn)品或待測樣本。待測樣本為經(jīng)過酶抑制劑處理后的樣 本，此樣本分為兩份，一份置于2-8°C，一份置于37°C，準(zhǔn)確計時一小時后，將兩種處理方法 的樣本置于樣本架。
[0265] 2、將樣本架插入Maglumi系列化學(xué)發(fā)光分析儀的樣本倉，編輯樣本號開始運(yùn)行試 驗(yàn)，具體加樣步驟為：校準(zhǔn)品或待測樣本加100 μ 1，然后加標(biāo)記有示蹤標(biāo)記物的抗A I抗體 溶液50 μ 1，加 A I抗原-BSA蛋白連接物標(biāo)記的FITC 50 μ 1，加抗FITC抗體包被的磁性微 球懸浮液20 μ 1，混勻，37°C溫育15分鐘，儀器自動清洗兩遍后直接進(jìn)入測量室得到各個樣 本的光強(qiáng)度信號，通過十點(diǎn)曲線及兩點(diǎn)定標(biāo)自動擬合出待測樣本的A I抗原濃度值。從而 同一個樣本在兩種溫度處理下得到不同的濃度值，將37°C處理的樣本濃度值減去2-8°C處 理的樣本濃度值，即得到腎素活性（PRA)。檢測結(jié)果見表1。
[0266] 對比例1
[0267] 采用市面上現(xiàn)有的某主流商品化放射性免疫試劑盒對實(shí)施例9中的120例臨床樣 本進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示。
[0268] 表 1
[0269]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測血管緊張素 I的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，所述試劑盒包括組分A和 組分B，所述組分A為血管緊張素 I抗原或血管緊張素 I抗原與蛋白載體的連接物，組分B 為抗血管緊張素 I抗體，所述組分A和組分B中的一種標(biāo)記有示蹤標(biāo)記物，另一種包被磁 球。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述蛋白載體選自牛血清白蛋白、人血清 白蛋白、兔血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、牛IgG、人IgG、卵清蛋白、肌紅蛋白和甲狀腺球蛋白中的 至少一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述示蹤標(biāo)記物選自金剛烷、魯米諾及其 衍生物、異魯米諾及其衍生物、叮啶酯、堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶中的至少一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述示蹤標(biāo)記物為N- (4-氨丁基）-N-乙 基異魯米諾。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁球?yàn)镕e 203或Fe 304磁性納米粒 子與有機(jī)高分子材料的復(fù)合體，并具有0. 1-5 μ m的粒徑；并且，所述磁球任選地通過表面 改性而帶有一種或多種活性功能基團(tuán)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，在所述試劑盒中，血管緊張素 I抗原 的濃度為〇. 002-0. 01mg/ml ;抗血管緊張素 I抗體的濃度為0. 05-lmg/ml ;磁球的濃度為 0· 05-lmg/ml ;示蹤標(biāo)記物的濃度為0· 2-lmg/l。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于， 所述示蹤標(biāo)記物直接或間接標(biāo)記組分A或組分B，所述間接標(biāo)記的方式包括通過異硫 氰酸熒光素與抗異硫氰酸熒光素抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系間接標(biāo)記組分A或 組分B ; 組分A或組分B直接或間接包被磁球，所述間接包被的方式包括通過異硫氰酸熒光素 與抗異硫氰酸熒光素抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系間接包被磁球。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括選自組分Al和組分A2 中的任意一種的組分，以及選自組分B1、組分B2和組分B3中的任意一種的組分；其中 組分Al為N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾直接標(biāo)記的血管緊張素 I抗原或血管緊張 素 I抗原與蛋白載體的連接物； 組分A2為鏈霉親和素標(biāo)記的N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾和生物素化的血管緊張 素 I抗原或血管緊張素 I抗原與蛋白載體的連接物； 組分Bl為抗血管緊張素 I抗體直接包被的磁球； 組分B2為生物素化的抗血管緊張素 I抗體和鏈霉親和素包被的磁球；以及 組分B3為抗血管緊張素 I抗體標(biāo)記的異硫氰酸熒光素和抗異硫氰酸熒光素抗體包被 的磁球。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括選自組分Cl和組分C2 中的任意一種的組分，以及選自組分D1、組分D2和組分D3中的任意一種的組分；其中 組分Cl為N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾直接標(biāo)記的抗血管緊張素 I抗體； 組分C2為鏈霉親和素標(biāo)記的N- (4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾和生物素化的抗血管緊 張素 I抗體； 組分Dl為血管緊張素 I抗原或血管緊張素 I抗原與蛋白載體的連接物直接包被的磁 球； 組分D2為生物素化的血管緊張素 I抗原或血管緊張素 I抗原與蛋白載體的連接物和 鏈霉親和素包被的磁球；以及 組分D3為血管緊張素 I抗原或血管緊張素 I抗原與蛋白載體的連接物標(biāo)記的異硫氰 酸熒光素和抗異硫氰酸熒光素抗體包被的磁球。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括血管 緊張素 I抗原的低點(diǎn)校準(zhǔn)品和高點(diǎn)校準(zhǔn)品，并任選地包括緩沖液。
11. 一種用于制備如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的試劑盒的方法，所述方法包括： 將組分A和組分B中的一種直接或間接標(biāo)記示蹤標(biāo)記物，將另一種直接或間接包被磁球。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于， 所述間接標(biāo)記包括將示蹤標(biāo)記物通過異硫氰酸熒光素與抗異硫氰酸熒光素抗體體系 或鏈霉親和素與生物素體系標(biāo)記所述組分A或組分B ; 所述間接包被包括將所述組分A或組分B通過異硫氰酸熒光素與抗異硫氰酸熒光素抗 體體系或鏈霉親和素與生物素體系間接包被磁球。
13. -種檢測血管緊張素 I濃度的方法，其特征在于，所述方法包括使用如權(quán)利要求 1-10中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，通過化學(xué)發(fā)光免疫法對待測樣品中的血管緊張素 I濃度進(jìn) 行檢測。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用如權(quán)利要求1-10中 任意一項(xiàng)所述的試劑盒，通過化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測血管緊張素 I濃度。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測血管緊張素Ⅰ的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法，所述試劑盒包括組分A和組分B，所述組分A為血管緊張素Ⅰ抗原或血管緊張素Ⅰ抗原與蛋白載體的連接物，組分B為抗血管緊張素Ⅰ抗體中的一種標(biāo)記示蹤標(biāo)記物，另一種包被磁球。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種使用該試劑盒來檢測血管緊張素Ⅰ濃度的方法。根據(jù)本發(fā)明，使用所提供的試劑盒測定血管緊張素Ⅰ的濃度，能夠獲得高的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。
【IPC分類】G01N33-543
【公開號】CN104634965
【申請?zhí)枴緾N201510069923
【發(fā)明人】饒微, 李欽, 徐紅, 彭露, 羅凱, 李婷華, 袁錦云
【申請人】深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月10日