并隨著樣品向前移動(dòng)，若樣品為陽(yáng)性，則樣品中的重金屬離子類目標(biāo)檢測(cè)物(analyte)會(huì)與Janus納米顆粒上標(biāo)記的檢測(cè)抗體(Janus-detect1n antibody)發(fā)生特異性的反應(yīng),并形成目標(biāo)檢測(cè)物_檢測(cè)抗體-Janus納米顆粒(analyte-detect1n antibody-Janus)的復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物經(jīng)過T線3時(shí)，如果目標(biāo)檢測(cè)物和檢測(cè)抗體反應(yīng)完全，則沒有多余的檢測(cè)抗體-Janus納米顆粒與T線3處的捕獲抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，因此在T線3處不會(huì)形成顏色條帶和產(chǎn)生熒光信號(hào)條帶，當(dāng)樣品繼續(xù)移動(dòng)到C線4時(shí)，檢測(cè)抗體則與C線4處的二抗發(fā)生特異性的反應(yīng)，形成顏色信號(hào)和熒光信號(hào)(圖9);若樣品為陰性時(shí)，樣品中沒有目標(biāo)檢測(cè)物與Janus納米顆粒上標(biāo)記的檢測(cè)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng))，因此，會(huì)在T線3處和C線4處形成顏色條帶和熒光信號(hào)條帶(圖10);只要C線4處未觀察到顏色條帶和熒光信號(hào)條帶，則證明該試紙條無效(圖11)。
[0050]下面通過實(shí)施例來說明本發(fā)明的免疫層析試紙條、其使用方法及檢測(cè)結(jié)果。
[0051]下面實(shí)施例中所用的試劑、儀器設(shè)備的來源:AFP的檢測(cè)抗體(Z111D1)、包被抗體(ZlllCl)和抗原購(gòu)自科躍中楷生物技術(shù)有限公司；羊抗兔抗體(bs-0295G)、羊抗鼠抗體(bs-0296G)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；三維平面劃膜儀和三維平面噴金儀購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；冷凍干燥機(jī)購(gòu)自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；切條機(jī)購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自默克密理博；PVC膠板、吸水紙、玻璃纖維膜和卡殼購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司。
[0052]實(shí)施例1:甲胎蛋白的檢測(cè)
[0053]我們以甲胎蛋白(AFP)作為大分子檢測(cè)的實(shí)施例。
[0054]1、免疫層析試紙條的制備:
[0055]實(shí)驗(yàn)中所用到的Janus納米顆粒為金納米顆粒-CdTe量子點(diǎn)(其中金納米顆粒(AuNPs)用于肉眼可視化檢測(cè)，CdTe量子點(diǎn)用于熒光定量檢測(cè))，將金納米顆粒和CdTe量子分別用鏈霉親和素(Streptavidin, SA)、生物素(B1tin)進(jìn)行修飾，然后通過鏈霉親和素與生物素的特異性反應(yīng)，最終成功地將金納米顆粒和CdTe量子點(diǎn)進(jìn)行連接，最終生成金納米顆粒-CdTe量子點(diǎn)的Janus納米顆粒(參考Sensitivity improved plasmonicgold nanoholes array b1sensor by coupling quantum—dot for the detect1n ofspecific b1molecular interact1ns, Lihong Niu, Ke Cheng, Zuliang Du,B1sensorsand, 2013，50，137-142)。
[0056](I)取100 μ g AFP的檢測(cè)抗體置于透析袋中對(duì)5mM Tris-HCl進(jìn)行透析24h，在此過程中，每隔2h換一次透析液，透析完成后，將所述檢測(cè)抗體取出置于離心管中，加入三蒸水至2mL，離心后棄去沉淀雜質(zhì)；
[0057](2)制備結(jié)合物墊:用濃度為0.0lM的K2CO3溶液調(diào)節(jié)Janus顆粒溶液的pH，攪拌均勻，然后加入離心好的抗體，攪拌20min左右，然后加入2mL10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，lOOOOrpm，離心40min，然后棄去上清液，再加入1%的BSA的溶液(含有ImM的pH8.6的緩沖溶液)繼續(xù)離心，棄去上清液，將沉淀物進(jìn)行恢復(fù)(恢復(fù)液的成分為:150mM的NaCl、1%的BSA、0.5%的蔗糖和0.5%的酪蛋白鈉)，將其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纖維膜上面，_45°C冷凍后，作為結(jié)合物墊，凍干后室溫避光保存?zhèn)溆茫?br>[0058](3)在PVC膠板上一端順次相互搭接地貼附樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜，另一端貼附有吸水紙；
[0059](4)通過三維平面劃膜儀在硝酸纖維素膜上包被T線和C線(T線與C線之間的間隔為4mm，設(shè)定參數(shù)都為I微升/厘米)，C線為檢測(cè)抗體的二抗，濃度為0.2mg/mL ;T線為AFP的包被抗體，濃度為0.2mg/mL ；
[0060](5 )將PVC膠板及貼附的材料切成4mm寬度的試紙條；
[0061](6)將步驟(5)中的試紙條裝入卡殼內(nèi)，卡殼上開有顯色區(qū)和加樣區(qū)，加樣區(qū)對(duì)準(zhǔn)樣品墊位置，顯色區(qū)對(duì)準(zhǔn)T線和C線所在區(qū)域；
[0062](7)將試紙條裝在鋁箔袋中，內(nèi)裝一個(gè)干燥劑和滴管，進(jìn)行密封室溫保存。
[0063]2、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及實(shí)際樣品檢測(cè)
[0064](I)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:打開鋁箔袋，取出試紙條，平放在檢測(cè)臺(tái)面上，然后在不同的試紙條的加樣區(qū)相對(duì)的樣品墊上，滴加含有不同濃度AFP的樣品100 μ L，10到15分鐘左右觀察結(jié)果，20分鐘以后檢測(cè)結(jié)果視為無效，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)；將不同濃度AFP的檢測(cè)試紙條置于化學(xué)熒光儀器中進(jìn)行讀數(shù)，并將所得到的數(shù)據(jù)及其對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到圖12所示的曲線。
[0065](2)實(shí)際樣品檢測(cè):開始檢測(cè)，打開鋁箔袋，取出試紙條，平放在檢測(cè)臺(tái)面上，然后滴加樣品100 μ L于加樣區(qū)相對(duì)的樣品墊上，10到15分鐘左右觀察結(jié)果，20分鐘以后檢測(cè)結(jié)果視為無效，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)觀察結(jié)果，如看到兩條紅色條帶，證明該樣品為陽(yáng)性，采用化學(xué)熒光儀器讀取熒光信號(hào)，進(jìn)一步定量分析。
[0066](3)根據(jù)化學(xué)熒光儀器讀取的熒光信號(hào)結(jié)合圖12所示的曲線圖判定AFP的定量濃度。
[0067]實(shí)施例2:沙丁胺醇的檢測(cè)
[0068]我們以沙丁胺醇作為小分子檢測(cè)的實(shí)施例，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法如下:
[0069]1、免疫層析試紙條的制備:
[0070](I)取100 μ g沙丁胺醇的檢測(cè)抗體置于透析袋中對(duì)5mM Tris-HCl進(jìn)行透析24h，在此過程中，每隔2h換一次透析液，透析完成后，將所述檢測(cè)抗體取出置于離心管中，加入三蒸水至2mL，離心后棄去沉淀雜質(zhì)；
[0071](2)制備結(jié)合物墊:用濃度為0.0lM的K2CO3溶液調(diào)節(jié)Janus顆粒溶液的pH，攪拌均勻，然后加入離心好的抗體，攪拌20min左右，然后加入2mL10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，1000rpm,離心40min，然后棄去上清液，再加入1%的BSA的溶液(含有ImM的pH8.6的緩沖溶液)繼續(xù)離心，棄去上清液，將沉淀物進(jìn)行恢復(fù)(恢復(fù)液的成分為:150mM的NaCl、1%的BSA、0.5%的蔗糖和0.5%的酪蛋白鈉)，將其涂覆在200平方厘米大小的玻璃纖維膜上面，_45°C冷凍后，作為結(jié)合物墊，凍干后室溫避光保存?zhèn)溆茫?br>[0072](3)在PVC膠板上一端順次相互搭接地貼附樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜，另一端貼附有吸水紙；
[0073](4)通過三維平面劃膜儀在硝酸纖維素膜上包被T線和C線(T線與C線之間的間隔為4mm，設(shè)定參數(shù)都為I微升/厘米)，C線為檢測(cè)抗體的二抗，濃度為0.2mg/mL ；T線為沙丁胺醇的抗原，濃度為0.2mg/mL ；
[0074](5 )將PVC膠板及貼附的材料切成4mm寬度的試紙條；
[0075](6)將步驟(5)中的試紙條裝入卡殼內(nèi)，卡殼上開有顯色區(qū)和加樣區(qū)，加樣區(qū)對(duì)準(zhǔn)樣品墊位置，顯色區(qū)對(duì)準(zhǔn)T線和C線所在區(qū)域；
[0076](7)將試紙條裝在鋁箔袋中，內(nèi)裝一個(gè)干燥劑和滴管，進(jìn)行密封室溫保存。
[0077]2、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及實(shí)際樣品檢測(cè)
[0078](I)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:打開鋁箔袋，取出試紙條，平放在檢測(cè)臺(tái)面上，然后在不同的試紙條的加樣區(qū)相對(duì)的樣品墊上，滴加不同濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品的樣品各100 μ L，10到15分鐘左右