Il-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后評價的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種IL-11作為生物標記物在胰腺癌診 斷和預后評價的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是預后最差的消化道惡性腫瘤之一，在我國居惡性腫瘤死亡原因的第六 位，確診后平均生存時間4-6個月。在中國，胰腺癌患者的5年生存率為1 % -3 %，僅 10%-15%的患者能夠進行根治術(shù)，手術(shù)根治是治愈胰腺癌患者的最重要的手段，但在根治 治療的胰腺癌患者中，其預后依然比較差。導致胰腺癌不良預后的主要原因是血液和淋巴 結(jié)腫瘤細胞的早期播散、腹腔腫瘤細胞的播散以至發(fā)生遠處的器官的轉(zhuǎn)移，且疾病的進展 兇險。由于胰腺癌的發(fā)生受到環(huán)境因素、多基因多階段等復制因素影響，目前對胰腺癌的早 期診斷和預后評估等方面還存在很多挑戰(zhàn)。缺少有效的實時動態(tài)檢測胰腺癌疾病早期進展 和預后評估的工具。
[0003] 影像學目前對胰腺癌的早期診斷、治療的監(jiān)測和預后的評估具有重要的作用，但 影像在檢測腫瘤的靈敏度方面具有局限性，只能檢測到直徑大于0. 3cm的腫瘤病灶，在治 療的監(jiān)測過程中，當影像檢測到胰腺癌發(fā)生遠處器官的轉(zhuǎn)移，患者往往失去治愈的機會， 預后比較差。血清腫瘤標記物也是目前常用的診斷和監(jiān)測治療的標記物，目前胰腺癌最 常用的血清標記物是唾液酸Lewis抗原CA19-9,主要作為輔助診斷和治療監(jiān)測的標記 物，CA19-9在某些疾病中升高，如良性阻塞性黃疸和胰腺炎患者中，甚至在腹水的患者血 清中也升高，另外在5%-10%的人群中Lewis抗原陰性，CA19-9值不會升高。細針穿刺 (fine-needle aspiration，F(xiàn)NA)細胞學診斷能夠提供細胞診斷的金標準，但此方法具有創(chuàng) 傷性，容易引起胰液滲漏等并發(fā)癥。
[0004] 目前對胰腺癌的診斷臨床多應(yīng)用影像方法，血清腫瘤標記物等，最終通過細胞病 理或者組織病理學確診胰腺癌。胰腺癌預后的評估最經(jīng)典的方式是病理?m，即病理分期 中腫瘤病理類型、腫瘤大小、腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移情況影響著患者預后。但由于胃癌患者個體差異 大，腫瘤細胞也存在異質(zhì)性。僅僅通過?m分期難以滿足臨床需要。胰腺癌的早期診斷及 預后評估等方面還存在很多缺陷和不足。
[0005] IL-11屬于IL-6細胞因子家族，具有抗炎作用，并且影響癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn) 移。通過血漿/血清中IL-6水平的異常變化將有助于對胰腺癌早期診斷和預后評估。為 胰腺癌的早期診斷及預后評價提供新型的生物標記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明實施例的目的在于提供一種血漿中IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷 和預后評價的方法，旨在解決現(xiàn)有的胰腺癌診斷和預后評估的方法存在的由于胃癌患者個 體差異大，腫瘤細胞也存在異質(zhì)性，僅僅通過TNM分期難以滿足臨床需要的問題。
[0007] 本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后評 價的方法，該IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后評價的方法利用ELISA方法檢測 血漿或血清中IL-11的表達；IL-11屬于IL-6因子家族；
[0008] 具體包括以下步驟：
[0009] 步驟一，采用血漿/血清樣本，用EDTA抗凝/無抗凝采血管抽取2-3mL靜脈血，室 溫靜置5分鐘后，4000rmp/min，離心5分鐘，獲取上清備用；樣本通常24小時內(nèi)完成檢測， 對于可能復查的標本；標本離心后，放置_80°C冰箱長期保存?zhèn)溆?；所有的試劑和樣本在?用之前放置在室溫18°C _25°C ;所有的樣本復空；
[0010] 步驟二，用p!19. 6的50mM碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，對血漿/血清樣本1 : 2稀 釋；
[0011] 步驟三，用PH9. 6的50mM碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，溶解IL-11蛋白質(zhì)標準品粉 末，充分震湯混勾后；制備成4ng/ml的標準品；取100ul的4ng/ml的標準品，加入400ul的 稀釋液，配制成800pg/ml的標準品，在6管分別加入400ul的稀釋液，800pg/ml的標準品 中移出 200ul，進行倍比稀釋，分別得到 266. 7pg/ml、88. 89pg/ml、29. 6pg/ml、9. 88pg/ml、 3. 29pg/ml、0pg/ml ;
[0012] 步驟四，加入lOOul的標準品于IL-11抗體包被的96孔板中，血漿/血清/細胞 上清/其他體液樣本1 : 2稀釋，用專用薄膜覆蓋孔后，室溫孵育2. 5小時或者4°C過夜，并 輕微震蕩；
[0013] 步驟五，用pH9. 6的50mM碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，將山羊抗人IL-11抗體稀釋 為2 y g/ml ;在聚苯乙烯的96孔酶標板的微孔中加入50 y 1包被液，用保鮮膜封好，在4°C 冰箱中放置過夜；次日，用350 y 1 150mM的PBST緩沖液浸泡式洗板，3minX 3次；
[0014] 步驟六，每孔加入300 y 1的2% BSA，室溫封閉4h;用350 y 1 PBST緩沖液浸泡式 洗板，lminX3次；
[0015] 步驟七，丟棄液體，用排槍或者自動加樣設(shè)備每孔加入300ul PBST緩沖液，每次均 需從孔中徹底清除液體；在最后一次洗滌時，完全去孔中殘存的液體，并倒置96孔板，在干 凈的吸水紙上排干；共洗滌4次；
[0016] 步驟八，在每孔中加入lOOul生物素標記的IL-11抗體，室溫孵育1小時，并輕微 震動；丟棄液體，用排槍或者自動加樣設(shè)備每孔加入300ulPBST緩沖液，每次均需從孔中 徹底清除液體；在最后一次洗滌時，完全去孔中殘存的液體，并倒置96孔板，在干凈的吸水 紙上排干；共洗滌4次；
[0017] 步驟九，加入lOOul鏈親和素溶液于每孔中，室溫孵育45分鐘并輕微震蕩；丟棄液 體，用排槍或者自動加樣設(shè)備每孔加入300ulPBST緩沖液，每次均需從孔中徹底清除液體； 在最后一次洗滌時，完全去孔中殘存的液體，并倒置96孔板，在干凈的吸水紙上排干；共洗 滌4次；
[0018] 步驟十，加入lOOul的TMB底物試劑于每孔中，室溫避光震蕩孵育30分鐘；加入 50ul2M1^04溶液終止反應(yīng)；在酶標儀Model 680酶標儀中讀取450nm吸光值；
[0019] 步驟十一，結(jié)果的判讀：首先確定3個陰性對照孔的讀數(shù)，取平均值作為本底讀 數(shù)；對于每一例血漿/血清/細胞培養(yǎng)液/其他體液樣品或IL-11標準品，先計算3個平行 孔的孔間變異系數(shù)CV，對于CV值小于10%的樣品，取3次重復的平均值作為樣品的0D值； CV值大于10%的樣品，去除一個異常值后，重新計算孔間變異，孔間變異=兩孔0D值之差 /兩孔0D值之和，變異值< 12%，樣品為有效病例，并取兩孔平均值作為樣品的0D值，否 貝1J，舍棄該例樣品，利用梯度稀釋的IL-11標準品繪制標準曲線，從而計算出每一例有效病 例的血漿/血清/細胞培養(yǎng)液/其他體液的IL-11濃度。
[0020] 進一步，該IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后評價的方法的IL-11屬于 IL-6因子家族，影響炎癥因子趨化作用、癌細胞的運動和侵襲作用。
[0021] 進一步，該IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后評價的方法檢測的標準和 方法：
[0022] 輔助診斷胰腺癌：血清中CA19-9未檢測明顯升高的患者，用EDTA抗凝/無抗凝采 血管抽取2-3mL靜脈血，在24h內(nèi)完成血漿/血清的IL-11檢測；
[0023] 預后的評估作用：對于臨床病理學明確診斷的胰腺癌患者，通過檢測血漿中 IL-11的表達水平評價胰腺癌患者的預后情況，用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL靜脈血，在 24h內(nèi)完成IL-11血漿檢測，患者在未經(jīng)過任何治療措施前用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL 靜脈血，在24h內(nèi)完成血漿/血清的IL-11檢測；在胰腺癌患者在手術(shù)后、化療后、放療后 3-7天檢測血漿/血清中IL-11的表達水平，或者在手術(shù)后、同步放化療后檢測血漿/血清 中IL-11的表達水平，最后，根據(jù)血漿/血清的IL-11的表達水平評價胰腺癌患者的預后情 況。
[0024] 本發(fā)明提供的血漿/血漿中IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后評價的方 法，測定血漿中IL-11的水平將對胰腺癌的早期診斷及預后的評價具有參考價值，有利于 胰腺癌的早期診斷和預后評估。本發(fā)明的方法靈敏度高，方法簡單，血漿標本獲得簡單無 倉|J，可重復性強。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實施例提供的血漿中IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后評 價的方法流程圖；
[0026] 圖2是本發(fā)明實施例提供的血漿/血清的IL-11表達水平診斷胰腺癌的靈敏度和 特異度示意圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明實施例提供的血漿/血清IL-11與胰腺癌患者預后的關(guān)系。當血漿 /血清水平大于50pg/mL，患者具有較好的預后示意圖。
【具體實施方式】
[0028] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0029] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0030] 如圖1所示，本發(fā)明實施例的血漿中IL-11作為生物標記物在胰腺癌診斷和預后 評價的方法包括以下步驟：
[0031] S1