滌時(shí)，完全去孔中殘存的液體，并倒置96孔 板，在干凈的吸水紙上排干。共洗滌4次。
[0057] 9)加入100ul鏈親和素（RayBiotech，GA，USA)溶液于每孔中，室溫孵育45分鐘 并輕微震蕩。丟棄液體，用排槍或者自動(dòng)加樣設(shè)備每孔加入300ulPBST緩沖液，每次均需 從孔中徹底清除液體。在最后一次洗滌時(shí)，完全去孔中殘存的液體，并倒置96孔板，在干凈 的吸水紙上排干。共洗滌4次。
[0058] 10)加入100ul的TMB底物（RayBiotech，GA，USA)試劑于每孔中，室溫避光震蕩孵 育30分鐘。加入50ul 2MH2S04溶液終止反應(yīng)。立即在酶標(biāo)儀Model680酶標(biāo)儀（Bio-rad 公司）中讀取450nm吸光值。
[0059] 11)結(jié)果的判讀：首先確定3個(gè)陰性對(duì)照孔的讀數(shù)，取平均值作為本底讀數(shù)。對(duì)于 每一例血漿/血清/細(xì)胞培養(yǎng)液/其他體液樣品或IL-11標(biāo)準(zhǔn)品，先計(jì)算3個(gè)平行孔的孔間 變異系數(shù)（CV)，對(duì)于那些CV值小于10%的樣品，取3次重復(fù)的平均值作為該樣品的0D值； CV值大于10%的樣品，去除一個(gè)異常值后，重新計(jì)算孔間變異（孔間變異=兩孔0D值之差 /兩孔0D值之和），如果該變異值< 12 %，認(rèn)為該樣品為有效病例，并取兩孔平均值作為該 樣品的0D值，否則，舍棄該例樣品。而后，利用梯度稀釋的IL-11標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從 而計(jì)算出每一例有效病例的血漿/血清/細(xì)胞培養(yǎng)液/其他體液的IL-11濃度。
[0060] 本發(fā)明的工作原理：
[0061] 利用ELISA方法檢測(cè)或血清血漿中IL-11的表達(dá)，檢測(cè)到血漿中IL-11大于 43. 2pg/mL可能提示胰腺癌，診斷的靈敏度是97. 7%，特異度為70%。并且血漿中IL-11水 平越高，胰腺癌患者預(yù)后預(yù)后。
[0062] 研宄對(duì)象分為兩個(gè)階段：第一階段為篩選階段：檢測(cè)44例病理明確診斷的胰腺癌 (中位年齡68y ;42-86)，30例健康志愿者，15例慢性胰腺炎患者的血漿/血清IL-11表達(dá)水 平。第二階段獨(dú)立驗(yàn)證階段：檢測(cè)45例病理明確診斷的胰腺癌（中位年齡69y ;42-87)，31 例健康志愿者，22例慢性胰腺炎患者的血漿/血清IL-11表達(dá)水平。血漿/血清IL-11的 診斷（AUC :0. 901，靈敏度：97. 7%，特異度：70. 0% )。胰腺癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、 腫瘤分期、血清乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、Y -谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血 紅蛋白表達(dá)水平等指標(biāo)與血漿/血清IL-11無(wú)相關(guān)性（P > 0. 05)，具有轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者 血漿中IL-11水平低于無(wú)轉(zhuǎn)移的患者（P = 0. 043)。胰腺癌患者血漿/血清中具有較高水 平的IL-11水平（中位值大于43. 2pg/mL)比低水平患者具有較好的預(yù)后（P = 0. 004)。尤 其當(dāng)血漿/血清中IL-11中位水平大于50pg/mL時(shí)，胰腺癌患者的中位生存期10月，而血 漿/血清的中位水平小于50pg/mL，胰腺癌患者的中位生存期為4個(gè)月，兩者的差異具有顯 著性意義（P = 0.004)。
[0063] 如圖2和圖3所示，本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)方法檢測(cè)不同分 期的胰腺癌患者血漿/血清中IL-11的表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)慢性胰腺癌、健康志愿者作為對(duì) 照，評(píng)估血漿/血清中IL-11的表達(dá)水平對(duì)胰腺癌的診斷和預(yù)后的評(píng)估意義。
[0064] 敏感性：此方法敏感性能夠在在血漿/血清中檢測(cè)小于3pg/ml。
[0065] 回收率：把人IL-11的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到40例健康人的血漿/血清中，并計(jì)算平 均回收率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種IL-Il作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法，其特征在于，該IL-Il 作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法利用ELISA方法檢測(cè)血漿或血清中IL-Il 的表達(dá)；IL-Il屬于IL-6因子家族； 具體包括以下步驟： 步驟一，采用血漿/血清樣本，用EDTA抗凝/無(wú)抗凝采血管抽取2-3mL靜脈血，室溫靜 置5分鐘后，4000rmp/min，離心5分鐘，獲取上清備用；樣本通常24小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，對(duì)于 復(fù)查的標(biāo)本；標(biāo)本離心后，放置_80°C冰箱長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?；所有的試劑和樣本在使用之前?置在室溫18°C_25°C;所有的樣本復(fù)空； 步驟二，用p!19. 6的50mM碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，對(duì)血漿/血清樣本1 : 2稀釋； 步驟三，用PH9. 6的50mM碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，溶解IL-Il蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品粉末，充 分震湯混勾后；制備成4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品；取IOOul的4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，加入400ul的稀釋 液，配制成800pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，在6管分別加入400ul的稀釋液，800pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品中移出 200ul，進(jìn)行倍比稀釋，分別得到 266. 7pg/ml、88. 89pg/ml、29. 6pg/ml、9. 88pg/ml、3. 29pg/ ml、0pg/ml; 步驟四，加入IOOul的標(biāo)準(zhǔn)品于IL-Il抗體包被的96孔板中，血衆(zhòng)/血清/細(xì)胞上清/ 其他體液樣本1 : 2稀釋，用薄膜覆蓋孔后，室溫孵育2. 5小時(shí)或者4°C過(guò)夜，并輕微震蕩； 步驟五，用邱9.6的50mM碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，將山羊抗人IL-Il抗體稀釋為 2yg/ml;在聚苯乙烯的96孔酶標(biāo)板的微孔中加入50y1包被液，用保鮮膜封好，在4°C冰 箱中放置過(guò)夜；次日，用350yI150mM的PBST緩沖液浸泡式洗板，3minX3次； 步驟六，每孔加入300y1的2%BSA，室溫封閉4h;用350yIPBST緩沖液浸泡式洗板，IminX3 次； 步驟七，丟棄液體，用排槍或者自動(dòng)加樣設(shè)備每孔加入300ulPBST緩沖液，每次均需從 孔中徹底清除液體；在最后一次洗滌時(shí)，去孔中殘存的液體，并倒置96孔板，在吸水紙上排 干；共洗絳4次； 步驟八，在每孔中加入IOOul生物素標(biāo)記的IL-Il抗體，室溫孵育1小時(shí)，并輕微震動(dòng)； 丟棄液體，用排槍或者自動(dòng)加樣設(shè)備每孔加入300ulPBST緩沖液，每次均需從孔中清除液 體；在最后一次洗滌時(shí)，去孔中殘存的液體，并倒置96孔板，在吸水紙上排干；共洗滌4次； 步驟九，加入IOOul鏈親和素溶液于每孔中，室溫孵育45分鐘并震蕩；丟棄液體，用排 槍或者自動(dòng)加樣設(shè)備每孔加入300ulPBST緩沖液，每次均需從孔中清除液體；在最后一次 洗滌時(shí)，去孔中殘存的液體，并倒置96孔板，在吸水紙上排干；共洗滌4次； 步驟十，加入IOOul的TMB底物試劑于每孔中，室溫避光震蕩孵育30分鐘；加入50ul2MH2SO^f液終止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀Model680酶標(biāo)儀中讀取450nm吸光值； 步驟十一，結(jié)果的判讀：首先確定3個(gè)陰性對(duì)照孔的讀數(shù)，取平均值作為本底讀數(shù)；對(duì) 于每一例血漿/血清/細(xì)胞培養(yǎng)液/其他體液樣品或IL-Il標(biāo)準(zhǔn)品，先計(jì)算3個(gè)平行孔的 孔間變異系數(shù)CV，對(duì)于CV值小于10%的樣品，取3次重復(fù)的平均值作為樣品的OD值；CV值 大于10%的樣品，去除一個(gè)異常值后，重新計(jì)算孔間變異，孔間變異=兩孔OD值之差/兩孔 OD值之和，變異值< 12%，樣品為有效病例，并取兩孔平均值作為樣品的OD值，否則，舍棄 該例樣品，利用梯度稀釋的IL-Il標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出每一例有效病例的血 漿/血清/細(xì)胞培養(yǎng)液/其他體液的IL-Il濃度。
2. 如權(quán)利要求1所述的IL-Il作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法，其特 征在于，該IL-Il作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法的IL-Il屬于IL-6因子 家族，影響炎癥因子趨化作用、癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲作用。
3. 如權(quán)利要求1所述的IL-Il作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法，其特 征在于，該IL-Il作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)和方法： 輔助診斷胰腺癌：血清中CA19-9未檢測(cè)明顯升高的患者，用EDTA抗凝/無(wú)抗凝采血管 抽取2-3mL靜脈血，在24h內(nèi)完成血漿/血清的IL-Il檢測(cè)； 預(yù)后的評(píng)估作用：對(duì)于臨床病理學(xué)明確診斷的胰腺癌患者，通過(guò)檢測(cè)血漿中IL-Il的 表達(dá)水平評(píng)價(jià)胰腺癌患者的預(yù)后情況，用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL靜脈血，在24h內(nèi)完 成IL-Il血漿檢測(cè)，患者在未經(jīng)過(guò)任何治療措施前用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL靜脈血， 在24h內(nèi)完成血衆(zhòng)/血清的IL-Il檢測(cè)；在膜腺癌患者在手術(shù)后、化療后、放療后3_7天檢 測(cè)血漿/血清中IL-Il的表達(dá)水平，或者在手術(shù)后、同步放化療后檢測(cè)血漿/血清中IL-Il 的表達(dá)水平，最后，根據(jù)血漿/血清的IL-Il的表達(dá)水平評(píng)價(jià)胰腺癌患者的預(yù)后情況。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種IL-11作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法，該IL-11作為生物標(biāo)記物在胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的方法利用ELISA方法檢測(cè)血漿或血清中IL-11的表達(dá)；IL-11屬于IL-6因子家族。本發(fā)明測(cè)定漿中/血清中IL-11的水平將對(duì)胰腺癌的早期診斷及預(yù)后的評(píng)價(jià)具有參考價(jià)值，有利于胰腺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。此外，本發(fā)明的方法靈敏度高，方法簡(jiǎn)單，血漿/血清標(biāo)本獲得簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)，可重復(fù)性強(qiáng)。
【IPC分類】G01N33-574
【公開號(hào)】CN104698170
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510115556
【發(fā)明人】任傳利, 王靜成, 韓崇旭, 王大新, 陳慧, 符德元, 馬莉
【申請(qǐng)人】任傳利
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日