基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 均相化學(xué)發(fā)光（Amplified Luminscent Proximity Homogeneous Assay, AlphaLISA)是一種新型的免疫檢測(cè)技術(shù)。均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)整個(gè)過(guò)程中不需要洗 滌，操作非常簡(jiǎn)單，靈敏度高。并且，均相化學(xué)發(fā)光動(dòng)態(tài)范圍寬（3-5個(gè)數(shù)量級(jí)），親和范圍大 (高低親和力的抗體均可應(yīng)用），抗干擾能力強(qiáng)，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。已廣泛用于藥物篩選，其 檢測(cè)原理如圖1所示。在均相條件下將帶有染料的供體微球、包被有活性分子且?guī)в邪l(fā)光 化合物的受體微球以及檢測(cè)樣本混合。此時(shí)供體微球和包被有活性分子的受體微球可迅速 有效地捕捉靶分子而形成免疫夾心復(fù)合物。在680nm的激發(fā)光照射下，供體微球中的光敏 物質(zhì)受到激發(fā)并催化周圍的氧分子形成高能態(tài)的單線態(tài)氧，該高能態(tài)的單線態(tài)氧擴(kuò)散至受 體微球，產(chǎn)生一系列的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后將能量傳遞給銪，發(fā)射出波長(zhǎng)為615nm的信號(hào)。 由于單線態(tài)氧在溶液中維持活性的時(shí)間很短（約4us)，只能擴(kuò)散約200nm的距離，因此只有 那些通過(guò)待測(cè)物質(zhì)連接在一起的受體微球和供體微球才能產(chǎn)生信號(hào)，當(dāng)生物分子不存在特 異的相互作用時(shí)，單線態(tài)氧無(wú)法擴(kuò)散到受體微球，則不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。
[0003] 均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)具有以下特點(diǎn)：
[0004] 1、不用洗滌：
[0005] 反應(yīng)在液體均相中進(jìn)行，只需要按次序加入樣品、受體微球、供體微球后溫浴，就 可以進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需洗滌，操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，可在96孔板、384孔板、1536孔板、3456 孔板中進(jìn)行反應(yīng)，可高通量，自動(dòng)化檢測(cè)大量樣品。
[0006] 2、高靈敏度：
[0007] 均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的檢測(cè)靈敏度較高，這是因?yàn)楣w微球含有高密度的光敏劑， 每個(gè)微球每秒可釋放高達(dá)60000個(gè)單線態(tài)氧分子，極大的擴(kuò)增了信號(hào)。
[0008] 3、適合生物大分子及相互作用的檢測(cè)：
[0009] 單線態(tài)氧分子在溶液中可以擴(kuò)散到200nm的距離，故在小于200nm的距離供體微 球與受體微球之間的相互作用均可以被檢測(cè)到，因此應(yīng)用光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)可檢測(cè)完整蛋 白質(zhì)、酶復(fù)合體、唾菌體等復(fù)雜的生物大分子及相互間的作用。其他均相技術(shù)，如時(shí)間分辨 焚光、焚光偏振，僅限于直徑為IOnm以內(nèi)的分子的檢測(cè)。由于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)具有以上 特點(diǎn)，已主要被應(yīng)用到藥物的大規(guī)模篩選方面。
[0010] 膠體金免疫層析技術(shù)的原理是以硝酸纖維素膜為固相載體，以膠體金作為示蹤標(biāo) 記物，與抗體結(jié)合，在微孔膜的滲濾作用或毛細(xì)管作用下，利用抗體反應(yīng)的高度特異性和膠 體金特有的顏色對(duì)金標(biāo)抗體與二抗的結(jié)合進(jìn)行示蹤，顯示肉眼可見(jiàn)的紅色條帶或斑點(diǎn)，從 而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性或定量分析。膠體金是由氯金酸在檸檬酸三鈉、白磷或其他還原劑 的作用下，聚合成大小不同的金顆粒，金顆粒之間是依賴于靜電作用，因而呈現(xiàn)一種穩(wěn)定的 膠體狀態(tài)，故而稱為膠體金。因?yàn)槟z體金顏色比較明顯，肉眼即可辨別，因此無(wú)需任何儀器； 檢測(cè)速度快，只需要10分鐘左右；產(chǎn)品為干式，沒(méi)有液體，運(yùn)輸和保存方便；操作簡(jiǎn)單等特 點(diǎn)。膠體金免疫層析試紙條得到了廣泛應(yīng)用。根據(jù)膠體金標(biāo)記目標(biāo)物的不同分為夾心法、 間接法和競(jìng)爭(zhēng)抑制法。夾心法和間接法主要針對(duì)大分子待測(cè)物，而對(duì)于小分子待測(cè)物因其 分子量比較小，空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，一般采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法。但是，膠體金試紙條具有靈敏度偏低， 容易產(chǎn)生假陽(yáng)性等缺點(diǎn)，很多需要高靈敏度檢測(cè)的物質(zhì)使用膠體金試紙條的方法達(dá)不到要 求。因此，膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)方法還不能滿足很多臨床檢測(cè)的需要，急需進(jìn)行改 進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙條， 該診斷試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快捷、簡(jiǎn)便、可定量，適合快速診斷等優(yōu)點(diǎn)。
[0012] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙 條，包括PVC底板、樣品墊、玻璃纖維墊、包被C線（即，控制線）以及T線（即，測(cè)試線）的 硝酸纖維素膜、吸水墊；
[0013] 在PVC底板的上表面固定設(shè)置硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的兩側(cè)分別設(shè)有玻 璃纖維墊和吸水墊；除玻璃纖維墊的右端下表面與硝酸纖維素膜的左端上表面固定相連之 外，玻璃纖維墊的其余下表面與PVC底板的上表面固定相連；除吸水墊的左端下表面與硝 酸纖維素膜的右端上表面固定相連之外，吸水墊的其余下表面與PVC底板的上表面固定相 連；在玻璃纖維墊的左側(cè)還設(shè)有樣品墊，除樣品墊的右端下表面與玻璃纖維墊的左端上表 面固定相連之外，樣品墊的其余下表面與PVC底板的上表面固定相連。
[0014] 作為本發(fā)明的基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙條的改進(jìn)：
[0015] 玻璃纖維墊中包被有偶聯(lián)了特異性抗體I的供體微球；
[0016] 該玻璃纖維墊的制備方法為：
[0017] 將偶聯(lián)了特異性抗體I的供體微球用釋放緩沖液稀釋至濃度為80~100ug/ml， 噴至玻璃纖維墊上，用量為：1~5ul/cm ;
[0018] 備注說(shuō)明：噴好后37°C烘干4小時(shí)；
[0019] 所述釋放緩沖液為：在100mL的10~lOOmmol/L、pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液或硼酸 鹽緩沖液中，加入10~40g蔗糖、3~IOg海藻糖、0.5~Ig的N，0-雙三甲硅基乙酰胺、 0. 2~0. 5g慶大霉素；
[0020] 硝酸纖維素膜（簡(jiǎn)稱為NC膜）的制備方法為：
[0021] 將偶聯(lián)了特異性抗體II的受體微球用分析緩沖液稀釋至濃度為200~300ug/ml， 然后噴至硝酸纖維素膜的T線位置；用量為：1~I. 5ul/cm ;
[0022] 將偶聯(lián)了能與所述特異性抗體I相結(jié)合的特異性抗體III的受體微球用分析緩沖 液稀釋至濃度為200~300ug/ml，然后噴至硝酸纖維素膜的C線位置；用量為：1~I. 5ul/ cm ；
[0023] 備注說(shuō)明：T線與C線是相互平行的兩條線，間距一般為5~7mm ;噴好后37°C烘 干4小時(shí)；
[0024] 所述分析緩沖液為：在IOOrnl的25mM、pH7. 4的HEPES緩沖液中加入100~500mg 的Dextran-500,加入NaCl直至其濃度為10~lOOmM、加入0· 1~Ig的BSA、0. 01~0· 05g 的牛 γ -球蛋白、〇· OOl ~〇· 5g 的 Tween_20、0· Ol ~0· 05g 的 Proclin-300 ;
[0025] 所述特異性抗體I和特異性抗體II均能與待測(cè)蛋白特異性結(jié)合，且結(jié)合在待測(cè)蛋 白質(zhì)的不同表位。
[0026] 作為本發(fā)明的基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙條的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0027] 特異性抗體I和特異性抗體II為以下任意一種：
[0028] 兔、羊、雞來(lái)源的抗待測(cè)蛋白質(zhì)的多抗，或者鼠、兔來(lái)源的抗待測(cè)蛋白質(zhì)的單克隆 抗體。
[0029] 作為本發(fā)明的基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙條的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0030] 所述玻璃纖維墊中：
[0031] 所述供體微球?yàn)樘碱w粒；
[0032] 所述特異性抗體I為兔抗人心肌肌鈣蛋白cTnl抗體、鼠抗人C反應(yīng)蛋白（CRP)單 克隆抗體1 ;
[0033] 硝酸纖維素膜（4)中：
[0034] 特異性抗體II為：鼠抗人心肌肌鈣蛋白cTnl單克隆抗體、鼠抗人C反應(yīng)蛋白 (CRP)單克隆抗體2 ;
[0035] 特異性抗體III為：羊抗兔IgG多克隆抗體、羊抗鼠 IgG多克隆抗體；
[0036] 受體微球?yàn)椋壕郾揭蚁┪⑶颍?，摻雜有銪配合物等物質(zhì)的聚苯乙烯微球，在吸收 溶液中的單線態(tài)氧后，可被激發(fā)出615nm的光）。
[0037] 作為本發(fā)明的基于均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速診斷試紙條的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0038] 玻璃纖維墊的制備方法中：將偶聯(lián)了兔抗人心肌肌鈣蛋白cTnl抗體的供體微球 用釋放緩沖液混合稀釋到80ug/ml，噴至（可采用BIO-DOT點(diǎn)膜儀）玻璃纖維墊上，用量為 lul/cm ；
[0039] 硝酸纖維素膜（4)(以下簡(jiǎn)稱NC膜）的制備方法中：將偶聯(lián)了鼠抗人心肌肌鈣蛋 白cTnl單克隆抗體的受體微球用分析緩沖液稀釋到200ug/ml，噴至硝酸纖維素膜（4)的T 線