一種檢測(cè)脂蛋白磷脂酶a2濃度的試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)樣本中脂蛋白磷脂酶 A2 (Lp-PLA2)濃度的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Lp-PLA2屬于磷脂酶A2超家族，是由441個(gè)氨基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶， 相對(duì)分子量為45kD。與磷脂酶A2家族其余成員不同的是，Lp-PLA2不需要鈣離子維持其 催化活性，其具有降解血小板活化因子的活性，因此也被稱為血小板活化因子乙酰水解酶 (platelet-activatingfactoracetylhydrolase，PAF_AH)。血液中Lp_PLA2主要由成熟的 巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成和分泌，在動(dòng)脈粥樣硬化部位大量存在，并可被炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)。 具有活性的Lp-PLA2能優(yōu)先水解氧化磷脂sn-2位上短脂酰鏈中的酯鍵而生成兩種強(qiáng)促炎 性介質(zhì)一一氧化游離脂肪酸和溶血卵磷脂。這兩種炎性介質(zhì)可作為單核細(xì)胞趨化因子，誘 導(dǎo)單核細(xì)胞的活化，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用。大量流行病學(xué)研宄顯 示Lp-PLA2是一種可以預(yù)測(cè)與冠脈事件有關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化和腦中風(fēng)危險(xiǎn)的酶，其作為一 種獨(dú)立的炎性因子，具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用。美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)和國(guó)家膽固醇教育計(jì) 劃提出，Lp-PLA2可以作為目前冠心病最好的預(yù)測(cè)因子，在未來的臨床決策中可能成為一個(gè) 獨(dú)立的檢測(cè)指標(biāo)。因此檢測(cè)人體Lp-PLA2的濃度對(duì)于判斷動(dòng)脈粥樣硬化炎癥水平具有十分 重要的參考價(jià)值，臨床上可用于心腦血管炎癥疾病的預(yù)測(cè)和診斷。
[0003]目前，在市面上檢測(cè)LP-PLA2濃度常用的試劑種類，檢測(cè)成本高，操作繁瑣，對(duì)實(shí) 驗(yàn)操作人員的技能要求高，不利于該項(xiàng)目檢測(cè)的大范圍推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)便、便于實(shí)驗(yàn)人員掌握、涉及實(shí) 驗(yàn)儀器單一、普及率高、檢測(cè)成本低、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、試劑穩(wěn)定性良好，非常利于大范圍推廣 的脂蛋白磷脂酶A2 (LP-PLA2)定量檢測(cè)試劑盒。
[0005] 一種檢測(cè)脂蛋白磷脂酶A2濃度的試劑盒，包括包被有抗脂蛋白磷脂酶A2特異性 抗體的平臺(tái)載體、脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品、脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控品、辣根過氧 化物酶標(biāo)記的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體、樣本緩沖液、底物A、底物B、終止液、洗液。
[0006] 作為優(yōu)選方案，所述平臺(tái)載體為96孔聚苯乙烯微孔板；所述底物A為過氧化氫的 檸檬酸鹽緩沖液；所述底物B為四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液；所述終止液為硫酸溶液； 所述洗液為含有表面活性劑的磷酸鹽緩沖液。
[0007] 作為優(yōu)選方案，所述微孔板上抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體的數(shù)量為 〇. 1-10Ug/孔；脂蛋白磷脂酶A2梯度標(biāo)準(zhǔn)品為6支、各0. 5ml;所述脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控 品為2支各0. 5ml;辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體10ml、1支；樣本 緩沖液l〇ml、1支；底物A10ml、1支；底物B10ml、1支；終止液10ml、1支；洗液10ml、1支。 [0008] 作為優(yōu)選方案，所述的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體為單克隆抗體。
[0009] 作為優(yōu)選方案，所述的脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和脂蛋白磷脂酶A2質(zhì) 控品都是用脂蛋白磷脂酶A2純品與自制的標(biāo)準(zhǔn)品按照1:100-1:2000稀釋液稀釋而成，所 述標(biāo)準(zhǔn)品不少于2個(gè)，所述質(zhì)控品和所述標(biāo)準(zhǔn)品的脂蛋白磷脂酶A2的濃度不同，所述質(zhì)控 品的作用是在試劑盒使用過程中起到核準(zhǔn)校對(duì)的作用，即通過質(zhì)控品測(cè)值是否在質(zhì)控范圍 內(nèi)來對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品擬合出來的曲線進(jìn)行核準(zhǔn)校對(duì)，若質(zhì)控品測(cè)值合格，則可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線來 擬合出樣本中的脂蛋白磷脂酶A2濃度值。
[0010] 作為優(yōu)選方案，所述脂蛋白磷脂酶A2純品是人血漿提純的天然脂蛋白磷脂酶A2 蛋白或大腸桿菌表達(dá)的重組脂蛋白磷脂酶A2蛋白。
[0011] 作為優(yōu)選方案，所述的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，其中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液是在PH6. 0-8.0、濃度為 10-100mM磷酸鹽緩沖液中，分別加入1% -10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清、0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的防腐劑、〇.l-l〇mM金屬離子絡(luò)合劑、0. 05-10 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑、1-10 %質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的抗原穩(wěn)定劑混合而成。
[0012] 作為優(yōu)選方案，所述樣本緩沖液是在PH6. 0-7. 0、濃度為10-100mM的磷酸鹽酸緩 沖液中，分別加入〇.l_5mM的金屬離子絡(luò)合劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清蛋白、0. 01-1% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑、〇. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而成。
[0013] 優(yōu)選的，所述的表面活性劑為曲達(dá)通X-100、曲達(dá)通X-705、吐溫20、吐溫40、吐溫 60、吐溫80、十二烷基磺酸鈉、聚乙二醇2000。
[0014] 作為優(yōu)選方案，所述的防腐劑為Proclin300、硫柳汞、疊氮鈉。
[0015] 作為優(yōu)選方案，所述的金屬離子絡(luò)合劑為乙二胺四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸四 鈉。
[0016] 作為優(yōu)選方案，所述的抗原穩(wěn)定劑為抗壞血酸、維生素E、2, 6-二叔丁基-4-甲基 苯酚（BHT)、還原型谷胱甘肽（GSH)。
[0017] 制備如上所述的試劑盒的方法，包括以下步驟，以下步驟不分前后順序：
[0018] 包被有抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體的平臺(tái)載體的制備：將濃度為6-10mg/ml特 異性的抗脂蛋白磷脂酶A2抗體用10-200mM磷酸鹽緩沖液稀釋到濃度為0. 1-10yg/ml，分 別加入到平臺(tái)載體上，4-8°C過夜進(jìn)行包被；然后用洗液將平臺(tái)載體清洗至少3次；再向平 臺(tái)載體上加入含蛋白保護(hù)劑的封閉液進(jìn)行封閉；棄去封閉液，等待平臺(tái)載體至干燥后，真 空袋封裝，4-8 °C存放；
[0019] 脂蛋白憐脂酶A2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和脂蛋白憐脂酶A2質(zhì)控品的制備：脂蛋白憐脂 酶A2純品與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋，最后配制成標(biāo)示濃度為0-1000ng/ ml的脂蛋白憐脂酶A2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品以及100-400ng/ml的脂蛋白憐脂酶A2質(zhì)控品；其中 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液是在pH6. 0-8. 0、濃度為10-100mM磷酸鹽緩沖液中，分別加入1% -4%質(zhì)量 分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清、〇. 05-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑、3-5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0. 1-0. 5% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑；將得到的脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品與脂蛋白磷脂酶A2質(zhì) 控品每瓶500ul分裝，然后凍干成粉末狀，4-8°C保存；
[0020] 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗脂蛋白磷脂酶A2抗體的制備：稱取過碘酸鈉加入到純 化水中配置得到終濃度為l〇-15mg/ml的過碘酸鈉溶液；將終濃度為10-15mg/ml的過碘酸 鈉溶液與濃度為10_20mg/ml的辣根過氧化物酶等比例混合得到被過碘酸鈉氧化過的辣根 過氧化物酶；然后將抗脂蛋白磷脂酶A2抗體與碳酸鹽緩沖液等體積混合稀釋；將被過碘酸 鈉氧化好的辣根過氧化物酶與特異性的抗脂蛋白磷脂酶A2抗體混合交聯(lián)；用去離子水溶 解硼氫化鈉成終濃度為8-12mg/ml;再透析后即得脂蛋白磷脂酶A2的酶標(biāo)抗體，通過分子 篩進(jìn)行分離純化；將所得酶標(biāo)抗體與甘油等體積混合，-15 --20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0021] 樣本緩沖液的配制：所述樣本緩沖液是在PH6. 0-7. 0、濃度為10-100mM的磷酸鹽 緩沖液中，分別加入〇.l_3mM的金屬離子絡(luò)合劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0. 01-1% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑、〇. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而成；
[0022] 底物A:將過氧化氫純品加入到濃度為10-100mM檸檬酸鹽緩沖液中，配制成過氧 化氫質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20-50%的檸檬酸鹽混合溶液；
[0023] 底物B:將四甲基聯(lián)苯胺加入到濃度為10-100mM檸檬酸鹽緩沖液中，配制成四甲 基聯(lián)苯胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-20 %的檸檬酸鹽混合溶液；
[0024] 終止液：將濃硫酸用純化水進(jìn)行稀釋；
[0025] 洗液：把質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05-1 %的表面活性劑加到PH6. 0-7. 0、濃度為10-100mM磷 酸鹽緩沖液中，然后混勻。
[0026] 本發(fā)明由于所用的檢測(cè)儀器較為簡(jiǎn)單，均為通常所用儀器，故檢測(cè)成本較低，利于 推廣；并且該試劑盒容易操作，一般實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員即可實(shí)現(xiàn)；同時(shí)試劑盒內(nèi)采用特異性 的Lp-PLA2抗體、添加獨(dú)特蛋白穩(wěn)定劑的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和樣本緩沖液配方，大大提高了檢 測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，以及試劑盒的穩(wěn)定性。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實(shí)施例5標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0028] 圖2為實(shí)施例6標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0029] 圖3為實(shí)施例7標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0030] 圖4為實(shí)施例8標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0031] 圖5為實(shí)施例9標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0032] 圖6為實(shí)施例10標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0033] 圖7為實(shí)施例11標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0034] 圖8為實(shí)施例12標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0036] 實(shí)施例1、抗脂蛋白磷脂酶A2鼠單克隆抗體的制備
[0037] 1雜交瘤細(xì)胞
[0038] 1. 1親本細(xì)胞
[0039] 1. 1. 1骨髓瘤細(xì)胞系
[0040] 融合所用的細(xì)胞系為制備雜交瘤常規(guī)使用的Sp2/0細(xì)胞系，Sp2/0細(xì)胞在無菌條 件下常規(guī)培養(yǎng)在含15%胎牛血清的IMDM完全培養(yǎng)液中，放置培養(yǎng)在37°C、含5%二氧化碳 培養(yǎng)箱中。
[0041] 1.1. 2免疫脾臟細(xì)胞
[0042] 用脂蛋白磷脂酶A2純品蛋白免疫BALB/C小