鼠，免疫劑量為30mg-60mg/每只小 鼠，經(jīng)皮下免疫動物。免疫前眼球取血，分離血清，保存在-20°C，作為正常對照小鼠的血清。 基礎免疫過程中抗原和完全佐劑等量混合，加強免疫中抗原與不完全佐劑混合，抗原與佐 劑經(jīng)充分乳化合格后免疫小鼠。第三次加強免疫后七天，眼球取血，用ELISA方法檢測，抗 血清0D值達到2. 0。取陽性小鼠用濃度為50mg/ml溶于生理鹽水的脂蛋白磷脂酶A2蛋白 沖擊免疫，免疫后3天，于無菌條件下取脾臟分離脾細胞，細胞懸浮在無血清IMDM完全培養(yǎng) 液中以備細胞融合。
[0043] 1. 2細胞融合和雜交瘤的篩選
[0044] 1. 2. 1細胞融合
[0045] 取1. 1.2中末次免疫沖擊后，無菌條件下分離的脾細胞與Sp2/0細胞以10 :1的 比例混合，用無血清頂DM培養(yǎng)液將混合細胞充分洗滌三次，（1000轉/分鐘，5分鐘）。將 脾細胞和sp2/0細胞輕微振蕩使之混勻后，將lml37°C預溫的50%PEG緩慢地加入到細胞 混懸液中，邊加邊輕輕地轉動試管，使PEG與細胞充分混勻。靜止1分鐘后，再緩慢地加入 37°C預熱的15ml無血清培養(yǎng)液，邊加邊輕輕地轉動試管，恢復滲透壓。800轉/分鐘，離心 融合細胞5分鐘。用無血清培養(yǎng)液將融合細胞洗滌兩次，再將細胞懸浮在含15%胎牛血清、 10%白介素6、HAT的IMDM完全培養(yǎng)液中。調整細胞濃度，將細胞加入到96孔細胞培養(yǎng)板 中，細胞數(shù)量為lX105/0.lml/每孔。同時在其中的一孔中加入Sp2/0細胞作為HAT篩選時 的對照細胞。將細胞培養(yǎng)板放置培養(yǎng)在37°C含5 %二氧化碳培養(yǎng)箱中。
[0046] 1. 2. 2雜交瘤細胞的篩選
[0047] 培養(yǎng)的第五天，在無菌條件下，將培養(yǎng)板的培養(yǎng)液換成含有15%胎牛血清、10%白 介素-6和HT的頂DM完全培養(yǎng)液，每孔200ul進行培養(yǎng)。在融合7天時可以見到雜交瘤的 生長。待培養(yǎng)孔中的雜交瘤細胞生長到約占1/3孔時，在無菌條件下吸取0.lml培養(yǎng)液，用 ELISA間接法測定雜交瘤分泌免疫球蛋白的情況。我們用ELISA間接法（lug/ml包被脂蛋 白磷脂酶A2抗原，100ul/孔4°C包被過夜；檢測抗體采用辣根酶標記的羊抗鼠IgG1:1萬 稀釋）從分泌免疫球蛋白的雜交瘤中篩選到40株對抗原呈陽性反應的細胞株。
[0048] 1. 3雜交瘤細胞的克隆
[0049] 采用有限稀釋法分別對這些與脂蛋白磷脂酶A2呈陽性反應的雜交瘤細胞株進行 了 3次克隆，選取ELISA篩選陽性率達到100%的的細胞株且450nm0D值大于2. 5。其中 2-D5和10-C2這兩株雜交瘤細胞與抗原反應有較高的靈敏度和較好的特異性，而且進一步 檢測表明他們識別的表位不同，選擇這兩株抗體進行純化。
[0050] 2抗體的制備
[0051] 2.1抗體上清的收集
[0052] 將上述兩個細胞株進行馴化，最后培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的MDM完全培養(yǎng)基 中進行擴增，并檢測其靈敏度和特異性。然后進行大量培養(yǎng)，待細胞量達到90%的條件下， 收集上清。
[0053] 2. 2抗體的分離純化
[0054] 取收集的細胞上清置于離心管中，于高速低溫離心機中，12000rpm離心lOmin，收 集上清。然后將上清直接過ProteinA柱子純化。先用結合緩沖液平衡ProteinA層析柱。 然后加入混合有結合緩沖液的預處理抗體原液，經(jīng)結合、洗滌和洗脫收集洗脫樣品后，將樣 品放在0. 02PB，pH7. 4的緩沖液透析過夜，透析液再離心12000rpm，20min。取上清即為純化 抗體，并為可以滿足用于制備試劑盒的抗體。
[0055] 2. 3抗體的鑒定
[0056] 用SDS-PAGE、WESTERN-BLOTTING和ELISA的方法對純化好的抗體進行鑒定，結果 表明抗體保留原有的特異性，純度大于95%。
[0057] 2. 4抗體的保存
[0058] 純化的抗體采用低溫保存，把抗體分成小包裝，置于-20°C~-80°C，保存過程中 避免反復凍融。經(jīng)快速活性鑒定，抗體活性可以保存一年效價不變。
[0059] 實施例2、本發(fā)明試劑盒的操作使用方法如下：
[0060] 1.將標準品和質控品用去離子水復溶混勾，分別向微孔板中加入標準品、質控和 樣本各20ul/孔和樣本緩沖液80ul/孔，放在振蕩反應器上室溫反應60min;
[0061] 2.用洗板機洗板四次，拍干；
[0062] 3.向微孔板中加入酶結合物100ul/孔，放在振蕩反應器上室溫反應60min;
[0063] 4.用洗板機洗板四次，拍干；
[0064] 5.底物A、底物B等體積混勻后，向微孔板中加入100ul/孔，37°C反應30min;
[0065]6.向微孔板中加入終止液100ul/孔；
[0066]7.利用酶標儀在450nm處讀取各反應孔的0D值；
[0067] 8.將標準品各點的濃度值和對應的0D值進行二次曲線回歸擬合出標準曲線，再 將樣本的0D值帶入標準曲線中，即可得出樣本中Lp-PLA2的對應濃度值。
[0068] 實施例3、通過以下方法制備該試劑盒：
[0069] 包被有抗脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體的微孔板的制備：將濃度為6mg/ml特異 性的抗脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體用PH值為7. 4的10mM磷酸鈉緩沖液稀釋到濃度為 0. 1yg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4°C包被過夜；移去包被液， 然后用洗板機將微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含1%質量分數(shù)牛血清白蛋白的 PH7. 4的10mM磷酸鈉緩沖液：300ul/孔，室溫封閉6小時；甩去凹孔中的封閉液，37°C烤干 4小時，真空袋封裝，4°C存放；
[0070] 脂蛋白憐脂酶A2濃度梯度標準品和質控品的制備：用含有0.ImM的乙>胺四乙 酸二鈉、0.01%質量分數(shù)的？1~〇(：1;[11300、1%質量分數(shù)的牛血清白蛋白、0.05%質量分數(shù)的 TritonX-100、l%質量分數(shù)的抗壞血酸的10mM磷酸鈉緩沖溶液（PH6. 0)將脂蛋白磷脂 酶A2純品配制成標示濃度為0、50、100、250、500、1000ng/ml的濃度梯度標準品以及100、 400ng/ml的質控品；然后用凍干機凍干成粉末狀，4°C保存；
[0071] 辣根過氧化物酶標記的抗脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體的制備：
[0072] (1)先稱取2mg辣根過氧化物酶溶解于0. 2ml蒸餾水中，得到濃度為5mg/ml的辣 根過氧化物酶。
[0073] (2)于上液中加入0?2ml新配的10mg/ml的似104溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0074] (3)將步驟（2)得到溶液裝入透析袋中，對10mMPH4. 4的磷酸納緩沖液透析，4°C 過夜。
[0075] (4)在步驟（3)得到的溶液中等體積加入0.2MPH9. 5碳酸納緩沖液，使以上醛化 好的辣根過氧化物酶PH升高到9. 0~9. 5,然后立即加入10mg特異性的抗脂蛋白磷脂酶 A2抗體，室溫避光輕輕攪拌2小時。
[0076] (5)向反應體系加入0? 2ml新配的4mg/mlNaBH4溶液，置4°C混勻2小時。
[0077] (6)將上述反應體系裝入透析袋中，對0.15MPH7. 4PBS透析，4°C過夜。
[0078] (7)將透析袋中的酶標抗體與甘油等體積混勻，-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0079] (8)將酶標抗體用含1 %牛血清白蛋白的20mMPBS緩沖液按照1:2000的比例進 行稀釋待用。
[0080] 樣本緩沖液的制備：向10mM磷酸鈉緩沖液（PH6. 0)中分別添加：0.ImMEDTA二 鈉、1%牛血清白蛋白、0.01%Tween20和0.01%Proclin300,充分混勻。
[0081] 底物A:向10mM檸檬酸鈉緩沖液（PH4. 0)中添加20%質量分數(shù)的過氧化氫，充分 混勻；
[0082] 底物B:向10mM檸檬酸鈉緩沖液（PH4. 0)中添加5%質量分數(shù)的四甲基聯(lián)苯胺，充 分混勻；
[0083] 終止液：1M的硫酸溶液；
[0084] 洗液：向10mM磷酸鈉緩沖液（PH6. 0)中加入0. 05%質量分數(shù)吐溫20,充分混勻；
[0085] 實施例4、通過以下方法制備該試劑盒：
[0086] 包被有抗脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體的微孔板的制備：將濃度為10mg/ml特異 性的抗脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體用PH值為7. 4的200mM磷酸鈉緩沖液稀釋到濃度為 10yg/ml，加入到96孔聚苯乙烯微孔板的凹孔中，100ul/孔，4°C包被過夜；移去包被液， 然后用洗板機將微孔板洗三次；再向微孔板凹孔中加入含1%質量分數(shù)的牛血清白蛋白的 PH7. 4的200mM磷酸鈉緩沖液：300ul/孔，室溫封閉6小時；甩去凹孔中的封閉液，37°C烤干 4小時，真空袋封裝，4°C存放；
[0087] 脂蛋白憐脂酶A2濃度梯度標準品和質控品的制備：用含有10mM的乙>胺四乙 酸二鈉、0. 5 %質量分數(shù)的Proclin300、10 %質量分數(shù)的牛血清白蛋白、10 %質量分數(shù)的 TritonX-KKK10%質量分數(shù)的抗壞血酸的10mM磷酸鈉緩沖溶液（PH6. 0)將脂蛋白磷脂 酶A2純品配制成標示濃度為0、50、100、250、500、1000ng/ml的濃度梯度標準品以及100、 400ng/ml的質控品；然后用凍干機凍干成粉末狀，4°C保存；
[0088] 辣根過氧化物酶標記的抗脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體的制備：
[0089] (1)先稱取2mg辣根過氧化物酶溶解于0. 2ml蒸餾水中，得到