濃度為5mg/ml的辣 根過氧化物酶。
[0090] ⑵于上液中加入〇? 2ml新配的10mg/ml的似104溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0091] (3)將步驟⑵得到溶液裝入透析袋中，對(duì)10mMPH4. 4的磷酸納緩沖液透析，4°C 過夜。
[0092] (4)在步驟（3)得到的溶液中等體積加入0. 2MPH9. 5碳酸納緩沖液，使以上醛化 好的辣根過氧化物酶PH升高到9. 0~9. 5,然后立即加入10mg特異性的抗脂蛋白磷脂酶 A2抗體，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。
[0093] (5)向反應(yīng)體系加入0? 2ml新配的4mg/mlNaBH4溶液，置4°C混勻2小時(shí)。
[0094] (6)將上述反應(yīng)體系裝入透析袋中，對(duì)0.15MPH7. 4PBS透析，4°C過夜。
[0095] (7)將透析袋中的酶標(biāo)抗體與甘油等體積混勻，-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0096] (8)將酶標(biāo)抗體用含1 %牛血清白蛋白的20mMPBS緩沖液按照1:2000的比例進(jìn) 行稀釋待用。
[0097] 樣本緩沖液的制備：向lOOmM磷酸鈉緩沖液（PH7. 0)中分別添加：3mMEDTA二 鈉、10 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白、1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Tween20和0. 5 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Proc1in 300,充分混勻。
[0098] 底物A:向lOOmM檸檬酸鈉緩沖液（PH4.0)中添加50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的過氧化氫，充分 混勻；
[0099] 底物B:向lOOmM檸檬酸鈉緩沖液（PH4.0)中添加20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的四甲基聯(lián)苯胺， 充分混勻；
[0100] 終止液：1M的硫酸溶液；
[0101] 洗液：向l〇〇mM磷酸鈉緩沖液（PH6. 0)中加入1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)吐溫20,充分混勻；
[0102] 實(shí)施例5、通過以下方法制備該試劑盒：
[0103] 與實(shí)施例3基本相同，不同的是：
[0104] 脂蛋白憐脂酶A2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備：用含有1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的新生 牛血清、0. 05%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Proclin300、3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白、0. 1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 TritonX-100、10mM的抗壞血酸的20mM磷酸鈉緩沖溶液（PH7. 4)將脂蛋白磷脂酶A2純品 配制成標(biāo)示濃度為0、50、100、250、500、1000叩/1111的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品以及150、300叩/1111的 質(zhì)控品；然后用凍干機(jī)凍干成粉末狀，4°C保存；
[0105] 樣本緩沖液的制備：向10mM檸檬酸鈉緩沖液（PH6. 4)中分別添加：lmMEDTA二 鈉、1%牛血清白蛋白、0? 1%Tween20、0. 1%BRIJ-35 和 0? 05%Proclin300,充分混勻。
[0106] 如附圖1所示為本實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，表1為采用實(shí)施例2所述的方法檢測(cè)本 實(shí)施例質(zhì)控品、樣本的檢測(cè)結(jié)果，其中樣本1、2來源于人體血漿，從表1可以看出質(zhì)控品1 和質(zhì)控品2的檢測(cè)值在對(duì)應(yīng)的靶值范圍內(nèi)，所以可以確定質(zhì)控品可控，結(jié)果可信；而樣本1、 2的檢測(cè)值偏差與其對(duì)應(yīng)的靶值相比，偏差小于15%，說明該試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確率高。
[0107] 表1質(zhì)控品、樣本檢測(cè)結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)脂蛋白磷脂酶A2濃度的試劑盒，其特征在于：包括包被有抗脂蛋白磷脂酶 A2特異性抗體的平臺(tái)載體、脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品、脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控品、 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體、樣本緩沖液、底物A、底物B、終止 液、洗液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述平臺(tái)載體為96孔聚苯乙烯微孔 板；所述底物A為過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖液；所述底物B為四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩 沖液；所述終止液為硫酸溶液；所述洗液為含有表面活性劑的磷酸鹽緩沖液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述微孔板上抗脂蛋白磷脂酶A2特異 性抗體的數(shù)量為〇. 1_1〇 U g/孔；脂蛋白憐脂酶A2梯度標(biāo)準(zhǔn)品為6支、各0. 5ml ;所述脂蛋 白磷脂酶A2質(zhì)控品為2支各0. 5ml ;辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗 體IOmlU支；樣本緩沖液IOmlU支；底物A IOmlU支；底物B IOmlU支；終止液IOmlU 支；洗液l〇ml、l支。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體 為單克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度的標(biāo) 準(zhǔn)品和脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控品都是用脂蛋白磷脂酶A2純品與自制的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照 1:100-1:2000 稀釋而成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述脂蛋白磷脂酶A2純品是人血漿提 純的天然脂蛋白磷脂酶A2蛋白或大腸桿菌表達(dá)的重組脂蛋白磷脂酶A2蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，是在PH 6. 0-8. 0、濃度為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液中，分別加入1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)物血清蛋白、 1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗原穩(wěn)定劑、〇. 05-10%體積分?jǐn)?shù)的表面活性劑、0.1 -IOmM的金屬離子絡(luò) 合劑以及0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述樣本緩沖液是在PH6. 0-7. 0、濃度 為IO-IOOmM的磷酸鹽酸緩沖液中，分別加入0. l-5mM的金屬離子絡(luò)合劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的動(dòng)物血清蛋白、0. 01-1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑、0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而 成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于：所述的金屬離子絡(luò)合劑為乙二胺 四乙酸二鈉或乙二胺四乙酸四鈉。
10. 制備如權(quán)利要求1-9所述的試劑盒的方法，其特征在于：包括以下步驟，以下步驟 不分前后順序： 包被有抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體的平臺(tái)載體的制備：將濃度為6-10mg/ml特異性 的抗脂蛋白磷脂酶A2抗體用10-200mM磷酸鹽緩沖液稀釋到濃度為0. 1-10 y g/ml，分別加 入到平臺(tái)載體上，4-8°C過夜進(jìn)行包被；然后用洗液將平臺(tái)載體清洗至少3次；再向平臺(tái)載 體上加入含蛋白保護(hù)劑的封閉液進(jìn)行封閉；棄去封閉液，等待平臺(tái)載體至干燥后，真空袋 封裝，4-8 °C存放； 脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品和脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控品的制備：脂蛋白磷脂酶A2 純品與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照1:200000-1:1000稀釋，最后配制成標(biāo)示濃度為O-lOOOng/ml的 脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品以及100-400ng/ml的脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控品；其中標(biāo)準(zhǔn) 品稀釋液是在pH 6. 0-8. 0、濃度為IO-IOOmM磷酸鹽緩沖液中，分別加入1% -10%質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的動(dòng)物血清、0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑、0.1 -IOmM金屬離子絡(luò)合劑、0. 05-10%質(zhì)量分 數(shù)的表面活性劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗原穩(wěn)定劑；將得到的脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度標(biāo)準(zhǔn) 品與脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控品每瓶0. 5ml分裝，然后凍干成粉末狀，4-8°C保存； 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗脂蛋白磷脂酶A2抗體的制備：稱取過碘酸鈉加入到純化水 中配置得到終濃度為l〇_15mg/ml的過碘酸鈉溶液；將終濃度為10-15mg/ml的過碘酸鈉溶 液與濃度為10_20mg/ml的辣根過氧化物酶等體積混合得到被過碘酸鈉氧化過的辣根過氧 化物酶；將抗脂蛋白磷脂酶A2抗體與碳酸鹽緩沖液等體積混合稀釋；將被過碘酸鈉氧化好 的辣根過氧化物酶與特異性的抗脂蛋白磷脂酶A2抗體混合交聯(lián)；將交聯(lián)后的產(chǎn)物與硼氫 化鈉溶液混合置4°C還原2小時(shí)；再用磷酸鈉溶液進(jìn)行透析，透析后即得脂蛋白磷脂酶A2 的酶標(biāo)抗體；將酶標(biāo)抗體與甘油等體積混勻，_20°C保存?zhèn)溆茫? 樣本緩沖液的配制：在PH6. 0-7. 0、濃度為IO-IOOmM的磷酸鹽緩沖液中，分別加入 0. l-3mM的金屬離子絡(luò)合劑、1-10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白保護(hù)劑、0. 01-1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性 劑、0. 01-0. 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的防腐劑混合而成； 底物A :將過氧化氫純品加入到濃度為IO-IOOmM檸檬酸鹽緩沖液中，配制成過氧化氫 為20-50 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檸檬酸鹽混合溶液； 底物B :將四甲基聯(lián)苯胺加入到濃度為IO-IOOmM檸檬酸鹽緩沖液中，配制成四甲基聯(lián) 苯胺為5-20 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檸檬酸鹽混合溶液； 終止液：將濃硫酸用純化水稀釋； 洗液：把質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 05-1 %的表面活性劑加到PH6. 0-7. 0、濃度為IO-IOOmM磷酸鹽 緩沖液中，然后混勻。
【專利摘要】本發(fā)明屬于體外免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)脂蛋白磷脂酶A2濃度的試劑盒及其制備方法。所述試劑盒包括包被有抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體的平臺(tái)載體、脂蛋白磷脂酶A2濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品、脂蛋白磷脂酶A2質(zhì)控品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗脂蛋白磷脂酶A2抗體、樣本緩沖液、底物A、底物B、終止液、洗液。本發(fā)明由于所用的檢測(cè)儀器較為簡(jiǎn)單，均為實(shí)驗(yàn)室通常所用儀器，故檢測(cè)成本較低，利于推廣；并且該試劑盒操作簡(jiǎn)單，一般的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員即可實(shí)現(xiàn)；同時(shí)試劑盒內(nèi)采用高特異性、高親和力的抗脂蛋白磷脂酶A2特異性抗體、添加獨(dú)特蛋白穩(wěn)定劑的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和樣本緩沖液配方，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，以及試劑盒的穩(wěn)定性。
【IPC分類】G01N33-535, G01N33-573
【公開號(hào)】CN104849456
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510251170
【發(fā)明人】鄭樂民, 張立峰, 李曉燕, 馬志軍, 吳建榕
【申請(qǐng)人】北京協(xié)和洛克生物技術(shù)有限責(zé)任公司
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月18日