作為癌癥標志的甲基乙二醛的制作方法
【專利說明】作為癌癥標志的甲基乙二醛
[0001] 本發(fā)明公開了用于人或動物受試者中癌癥的新的、可靠的、靈敏的和便利的操作 診斷和預后試驗。發(fā)明人在本文中首次證實，具有癌癥的受試者的生物樣品中甲基乙二醛 (methylglyoxal)(MG)的水平增加與具有代謝活性的癌細胞發(fā)育和進展高度正相關(guān)。這 一結(jié)果強調(diào)，癌細胞產(chǎn)生和釋放顯著高于腫瘤和生物體細胞外液中正常細胞的MG的量，因 此，能夠從獨特的血樣中獲得癌癥的可靠和靈敏的診斷和預后試驗。本發(fā)明由此涉及用于 早期檢測和診斷癌癥以及用于在具有癌癥的受試者中預后評價、監(jiān)測和作出治療決定的體 外方法；其通過測量MG的存在來進行。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著在全世界被診斷為癌癥病例數(shù)量的逐步增長和因該疾病晚期發(fā)現(xiàn)導致的死 亡數(shù)量持續(xù)增高，鑒定用于早期檢測和靶向治療干預的新生物標志（biomarker)被廣泛接 受為對癌癥預防和經(jīng)治療的癌癥患者中的更好結(jié)果是決定性的。癌癥是全世界第二位死亡 率最高的原因，其中肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌（女性）、胰腺癌和前列腺癌（男性）最常見。
[0003] 目前，最常用的癌癥診斷和預后指示劑基于腫瘤的形態(tài)和組織學特征，因為沒有 可利用的具有足夠用于診斷的靈敏度和特異性的血液生物標志；且僅存在少量生物標志用 于癌癥的治療監(jiān)測和預后評價。
[0004] 美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA)已經(jīng)將生物標志定義為分子特征，它被客觀測 量和評價并且指示正常生物過程、致病過程或?qū)χ委煾深A的藥理學響應。這樣的生物標志 可以由腫瘤自身或身體對正常細胞轉(zhuǎn)化成癌性的惡性壓力作出響應而產(chǎn)生。根據(jù)美國國立 癌癥研宄所（NCI)，生物標志可以用于癌癥篩查、風險度評價、疾病的早期診斷、監(jiān)測、預后 評價、作出治療決定和預測對療法的響應。
[0005] 然而，限制這種腫瘤學生物標志潛力的主要挑戰(zhàn)在于，癌癥發(fā)生和加速增長和腫 瘤發(fā)展是復雜的過程，其涉及各種異常遺傳和外遺傳的分子事件和細胞相互作用。
[0006] 惡性轉(zhuǎn)化導致特異性和非特異性表型細胞特征（signature)改變，由此導致生物 體中癌細胞的克隆選擇和進展。此外，癌癥可以因暴露于多種和不同環(huán)境致癌劑，例如化學 物質(zhì)、福射和/或微生物中導致；尤其是在易感宿主中（Belpomme等人，Environ Res 2007 ; Irigaray 和 Belpomme, Carcinogenesis 2010)〇
[0007] 作為致癌過程的如此復雜性的結(jié)果，腫瘤在病因?qū)W和發(fā)病機制中廣泛改變，因此， 癌癥由超過200種侵害超過60種人體器官的不同的疾病組成。這種復雜性也是為什么盡 管許多生物測定尋找臨床腫瘤終點與生物標志之間的相關(guān)性，但是仍然幾乎沒有臨床有用 的生物標志（這些生物標志有助于腫瘤科醫(yī)生作出決定和患者護理）的原因，和無關(guān)鍵的 可利用的可以檢測所有甚至許多類型癌癥的單一生物標志的原因。本發(fā)明通過提供新的單 一生物標志協(xié)調(diào)了許多這些局限，所述生物標志允許通過在患者/受試者的生物樣品中進 行簡單測量來檢測許多類型的癌癥。這種測量非常具有再現(xiàn)性；以便檢測癌癥，甚至在早期 階段。
[0008] 本發(fā)明基本上在于測量代謝副產(chǎn)物甲基乙二醛（MG)的產(chǎn)生水平，其通過檢測和 定量來自受試者的生物樣品中這種分子的量來進行。
[0009] 圖1是顯示真核細胞中糖酵解代謝過程和甲基乙二醛（MG)形成的示意圖。
[0010] 能量的完整糖酵解途徑是厭氧的（不使用氧）。需氧條件中的正常細胞進入Krebs 三羧酸（TCA)循環(huán)而產(chǎn)生腺苷三磷酸（ATP);而仍然在需氧條件下，Warburg效應引導許多 癌細胞而不是進入Krebs TCA，從而增加糖酵解（即"需氧糖酵解"）。在糖酵解過程中，MG 途徑繞過傳統(tǒng)的糖酵解恩布頓-邁耶霍夫_帕納斯途徑并且是代謝盲路（cul-de-sac);因 此，這種途徑導致作為廢物終產(chǎn)物/副產(chǎn)物的MG和D-乳酸鹽形成，而糖酵解恩布頓-邁耶 霍夫-帕納斯途徑導致丙酮酸鹽形成，然后在需氧條件中導致Krebs TCA或在厭氧條件中 由丙酮酸鹽形成L-乳酸鹽。作為在許多癌細胞中的情況，Krebs TCA或呼吸鏈中的任何缺 陷通過二羥丙酮磷酸鹽形成增加來增加糖酵解以補償ATP產(chǎn)生和隨后的MG形成。
[0011] 圖Ibis顯示人癌細胞系（HCT16)的培養(yǎng)基中MG的產(chǎn)生取決于在培養(yǎng)基中存在低 或高葡萄糖濃度。通過使用液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS)分析對條件培養(yǎng)基（CM) 進行MG定量。相對于在低葡萄糖條件而言，在高葡萄糖條件下，癌細胞產(chǎn)生10倍更高的 MG，發(fā)現(xiàn)如下啟示，癌細胞的MG合成和釋放直接取決于葡萄糖消耗和代謝。
[0012] 圖2顯示通過使用直接組織分析、用MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法在惡性PRO細胞克隆 中的MG產(chǎn)生。PRO細胞克隆最初得自由1，2_二甲肼施用誘導的結(jié)腸腺癌。在不染色和分 別使用掃描1和2中的蘇木精-曙紅-Safran(HES)染色后表示腫瘤。用MALDI-T0F/T0F 質(zhì)譜法的MG瘤內(nèi)檢測表示在分別得自91Da和118Da 2MQX分子碎片分析的掃描3和4中。 注意在壞死區(qū)中，在1和2中腫瘤的中部和下部中占優(yōu)勢，3和4中的MG顯然較少被檢測 到，而顯然主要在用HES高度著色的一些區(qū)域中檢測到。
[0013] 圖3顯示具有癌癥的患者中MG血液水平與腫瘤階段之間的顯著正相關(guān)性。無論 癌癥階段如何，大多數(shù)MG血液水平值均高于0. 06 y M的MG的正常（非癌性的）對照值（p =0. 0109)，表明血液中的MG的全身測量是診斷癌癥的有效工具；關(guān)鍵是能夠便利和早期 檢測和篩查。
[0014] 圖4顯示癌癥患者與對照組（正常受試者或血糖正常的（經(jīng)治療的）2型糖尿病 患者）之間血液MG與血糖比率（MG/G指數(shù)）的差異（p〈0. 01)。注意在正常對照組與具有 正常血糖的經(jīng)治療的2型糖尿病的受試者之間的MG血液水平無顯著性差異。
[0015] 圖5公開了植入PRO致瘤的癌性結(jié)腸細胞后發(fā)育的BD-IX大鼠中MG血液水平與 腫瘤體積之間的顯著正相關(guān)性（p〈〇. 001)。PRO和REG細胞克隆最初來源于BD-IX大鼠中 1，2-二甲肼誘導的單一結(jié)腸腺癌。
[0016] 圖6顯示當皮下注入同系宿主時，PRO細胞如親代細胞誘導進行性腫瘤，而REG細 胞誘導在3周后退化的腫瘤。PRO細胞的腫瘤移植物與腫瘤體積的恒定進展相關(guān)，因此，注 意到MG血液水平與腫瘤體積之間的正相關(guān)性；移植后3周，存在MG血液水平恒定進展。移 植后3周REG癌細胞的腫瘤移植物被排斥，而血液中的MG在整個實驗期間保持在低水平。 通過比較使用PRO致瘤的癌細胞克隆得到的結(jié)果（圖5)，這啟示活躍進展的癌癥且更具體 地是增殖性致瘤的癌細胞合成大量MG ;而無進展的癌癥、更具體地是無增殖性無致瘤的癌 細胞則不能。
[0017] 圖7顯示在癌癥患者（B)中，MG血液水平與體重指數(shù)（BMI) (p = 0? 0064)顯著成 負相關(guān)性；而MG與BMI在正常受試者中不存在相關(guān)性（A)。這表明MG由癌細胞產(chǎn)生。
[0018] 圖8顯示在癌癥患者中，胰島素/葡萄糖比率（I/G)指數(shù)與MG血液水平之間存在 顯著的負相關(guān)性，而在正常健康受試者中的I/G指數(shù)保持恒定。因此，2種曲線的交叉點允 許臨界點的個體化，此時〇. 2 y M血液MG水平稱作"惡病質(zhì)-相關(guān)的對照值"，高于它，胰島 素抵抗更高，而胰島素分泌更低（相對于正常受試者而言）；使得癌癥患者正在進入惡病質(zhì) 或嚴重前-惡病質(zhì)。
[0019] 表1顯示與用作對照組的正常受試者和具有正常血糖的經(jīng)治療的2型糖尿病的患 者相比，癌癥患者中的MG血液水平平均值（土標準誤差和置信區(qū)間）（以yM計）。
[0020] 表2顯示根據(jù)腫瘤類型與用作對照組的正常受試者和具有正常血糖的經(jīng)治療的2 型糖尿病的患者相比，癌癥患者中的MG血液水平平均值（土標準誤差和置信區(qū)間）（以yM 計）。
[0021] 表3公開了根據(jù)臨床響應在治療的癌癥患者中MG血液水平的平均值（土標準誤 差）（以UM計）；即，完全響應、部分響應或穩(wěn)定/進行性疾病，正如通過使用成像技術(shù)的 直接臨床腫瘤和/或腫瘤測量值確定的。在具有如通過傳統(tǒng)成像技術(shù)確定的顯著完全臨床 響應的2位患者中，MG血液水平高于正常值。在這2位患者中，癌癥在3和7個月后復發(fā)。
[0022] 表4公開了根據(jù)其BMI在治療的不同癌癥患者中MG血液水平的平均值（土標準 誤差）（y M)。3種BMI類別之間的差異具有高度的統(tǒng)計學顯著性，且前-惡病質(zhì)或惡病質(zhì) 狀態(tài)（BMK18)與顯著更高的MG血液水平相關(guān)（相對于具有超重/肥胖癌癥（BMI>25)的 患者而言）。
[0023]生物樣品:本文所用的術(shù)語"生物樣品"是指得自患者或正常個體的各種樣品類 型，其用于診斷性監(jiān)測試驗。所述生物樣品包括任意的細胞外液，例如血液、血清、血漿、尿 或其它液體樣品，例如唾液、腹膜液或胸膜液、腦脊髓液、胃液或結(jié)腸直腸流體、淋巴液、滑 液、間隙液、羊膜液、生理分泌物、淚液、粘液、汗液、乳、精液、陰道分泌物和來自潰瘍和其它 表面滲出的流體。它們也可以是實體組織，例如腫瘤或器官和例如得自子宮頸、骨髓、淋巴 結(jié)等的細胞涂片。術(shù)語"生物樣品"還包括構(gòu)成生物體內(nèi)胞外隔室的胞外基質(zhì)和細胞外液。 它不僅包括臨床樣品，而且包括細胞培養(yǎng)物和組織培養(yǎng)物和來源于它們的細胞及其子代。
[0024]甲基乙二醛:在本發(fā)明中，"甲基乙二醛"是指如下發(fā)現(xiàn)，癌細胞產(chǎn)牛并目.釋放顯著 高于正常細胞所產(chǎn)生和釋放的量的甲基乙二醛（MG)，由此可以在生物體的腫瘤和細胞外液 中（特別是在MG從癌細胞中釋放后的外周血液中）測量和定量MG。
[0025] 通過體外測量自然存在于生物體中的游離MG部分或通過測量游離MG的總量證 實樣品中的MG，所測得的游離MG總量相當于自然存在于樣品中的除可以從通過已使用 與Chaplen類似或相同的技術(shù)處理樣品后可逆配體結(jié)合的MG中回收的MG之外的游離 MG(Chaplen 等人，Anal Biochem 1996 ;Chaplen 等人.，PNAS 1998)。最初研發(fā)這樣的方法 是為了測量胞內(nèi)可逆配體-結(jié)合的MG。
[0026] 因此，通過本發(fā)明方法測量其水平的MG相當于在個體腫瘤或體液中、更特別是在 外周血液中測量的游離MG分子水平，其原因在于，它可以使得臨床應用生物標志極為簡 便。然而，如上所示，本發(fā)明的方法不僅唯一依賴于自然存在于生物體腫瘤或胞外隔室中的 游離MG的測量值，而且還依賴于在體外處理可逆配體-結(jié)合的MG之后回收的游離MG的測 量值。然而，當術(shù)語"MG"、"MG產(chǎn)生"或"MG產(chǎn)生水平"在本文中未進一步定義使用時，MG 水平相當于被視為自然存在于樣品中的游離分子，而不相當于可以從樣品中回收的游離MG 總量，不過，其測量值也包括在本發(fā)明中。
[0027] 術(shù)語"牛物樣品"包括其取得后以任意方式操作的樣品。
[0028] 可以在MG分析前"處理"所述生物樣品，例如通過：由血液制備血漿；從樣品中消 除細胞或使得細胞群富集；稀釋粘液流體等。本發(fā)明的方法可以包括過濾、蒸餾、濃縮、使干 擾化合物失活、細胞裂解；例如通過超聲處理、添加試劑、細胞固定或?qū)嶓w組織固定，然后進 行MG分析。所謂MG分析前經(jīng)處理的樣品的實例使用用于回收胞內(nèi)和/或胞外可逆配體結(jié) 合的 MG 的技術(shù)（Chaplen 等人，Anal Biochem 1996 ;Chaplen 等人，PNAS 1998)〇
[0029] 受試者、個體、患者:本文所用的術(shù)語"受試者"或"個體"是指任意年齡或性別的 無論是健康的還是患有疾病的人（或動物）；而術(shù)語"患者"是指具有疾病的受試者或個體， 例如具有癌癥或糖尿病的患者。
[0030] 術(shù)語'健康#試者'和'健康個體'是指已經(jīng)通過使用常規(guī)的醫(yī)學檢驗證實無任 何可檢測到的疾病的無癥狀受試者或個體。更精確地，這些術(shù)語是指已經(jīng)證實無癌癥、糖尿 病、慢性尿毒癥、動脈高血壓和阿爾茨海默病的人。
[0031] 癌癥或白血病:這@術(shù)語是指腫瘤，其細朐存在異常惡件表塑，其特征在于在牛物 體中主要包括自主生長和細胞增殖調(diào)節(jié)缺失的嚴格公認和經(jīng)驗證的標志。近來更精確地綜 述和分析了這些標志（Hanahan和Weinberg, Cell 2011)。相反，術(shù)語"腫瘤"是指可以存在 惡性或非惡性表型的細胞。術(shù)語"良性腫瘤"用于表征這樣的腫瘤，其增殖能力保持受限， 因為細胞不包含惡性表型。
[0032] 對有關(guān)通過本發(fā)明方法鑒定的癌癥類型沒有特別限制；它們包括實體癌和非實體 癌，包括上皮或非上皮類型。
[0033] 上皮來源的癌癥包括所有組織學類型，例如腺癌和鱗狀細胞癌；和所有局部化癌， 例如頭頸癌（即口腔、舌、口咽、BB、喉等）、支氣管和肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺 癌、肝癌（和所有其它消化道類型）、宮頸和子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、泌尿生殖器癌（前列腺癌、 膀胱癌、腎癌）等。非上皮癌主要在于任意類型的白血病、淋巴瘤、黑素瘤或肉瘤。
[0034] 通過本發(fā)明也可以鑒定其它癌癥。例如，睪丸癌癥、無性細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、星 形細胞瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、兒童癌癥和HIV-相關(guān)腫瘤等。
[0035] 所謂癌癥的"早期檢測"在本文中應理解為是指無癥狀受試者中確定的亞臨床的 (無明顯可診斷的）顯微鏡可見的已經(jīng)具有代謝活性的癌癥的檢測或鑒定。
[0036] 所謂癌癥的"籃查"應理解為是指在無癥狀個體群體中具有代謝活性的癌癥或癌 前期病變的全身檢測。
[0037] 所謂癌癥的"途逝"應理解為是指在有癥狀患者中已經(jīng)具有肉眼可見的進行性癌 癥的檢測。本發(fā)明的檢測/診斷方法由此專用于檢測所謂的癌前期病變，這些病變可以在 組織活檢中證實，但可能不一定發(fā)展至確切的具有代謝活性的顯微鏡可見的癌癥。而本發(fā) 明易于且可靠地檢測到確切增殖和進行性癌癥。這可能以亞臨床的顯微鏡可見的病變的形 式發(fā)生在無癥狀受試者中或以更晚期的病變的形式發(fā)生在有癥狀受試者中，然后可以通過 通常可利用的臨床診斷工具所證實。由于MG水平涉及發(fā)展中的癌細胞的代謝活性，所以本 發(fā)明的檢測/診斷方法不僅可以用于在無癥狀受試者中篩查具有代謝活性的癌癥，而且可 以用于在有癥狀受試者中的增殖性癌癥的發(fā)展，且由此在這樣的受試者中評估癌癥將臨床 進展的可能性；然后可以通過通?？衫玫呐R床工具證實癌癥進展。
[0038] 本f所用的術(shù)語"MG iH常對照倌"或"MG參比倌"是