方法能夠檢測(cè)頭頸癌、支氣管癌和肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸 癌、胰腺癌和其它消化道癌癥，還有卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌、腎癌和膀胱癌、白血病和非霍奇 金淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MG正常對(duì)照值是已經(jīng)在健康個(gè)體的 生物樣品中測(cè)量的所述MG產(chǎn)生水平。優(yōu)選地，這種全血值為0. 06 yM±0.02,其中置信區(qū)間 為0. 02 y M-0. 11 y M。此外，本發(fā)明還包括用于測(cè)定腫瘤的增殖攻擊性的方法，包括測(cè)定所 述受試者的生物樣品中的MG和將測(cè)量的MG產(chǎn)生水平與其對(duì)照值進(jìn)行比較的步驟。
[0095]3.癌癥的早期檢測(cè)和診斷：糖尿病患者
[0096]在30位未治療的1型和2型糖尿病患者中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)選顯著性更高的癌癥發(fā)病 率。然而，已知MG的產(chǎn)生水平在血糖過多的條件下，即在未治療或未正確治療的糖尿病患 者中增加（McLellan，Clin Sci 1994)。因此，目前的MG癌生物標(biāo)志在這些患者中可能易混 淆。
[0097] 本發(fā)明的目的由此在于，MG/G指數(shù)甚至能夠在糖尿病患者中識(shí)別那些可能具有癌 癥或不可能具有癌癥的患者。這種指數(shù)的評(píng)價(jià)由此能夠早期檢測(cè)和診斷糖尿病患者中的癌 癥且由此可以改善這些患者中的癌癥預(yù)后。
[0098] 本發(fā)明由此涉及用于早期檢測(cè)、篩查和診斷糖尿病受試者中癌癥的體外方法，包 括下述步驟：
[0099] a)測(cè)定所述糖尿病受試者的第一生物樣品中的MG產(chǎn)生水平；
[0100] b)測(cè)定所述受試者的第二生物樣品中的葡萄糖水平；
[0101] C)將這兩種水平的MG/G比率（MG/G指數(shù)）與相應(yīng)的在健康個(gè)體和血糖正常的經(jīng) 治療的糖尿病受試者中測(cè)量的對(duì)照比率進(jìn)行比較，其中如果步驟c)中得到的MG/G指數(shù)高 于所述相應(yīng)的對(duì)照比率，則認(rèn)為所述受試者患有癌癥或處于增加的癌癥風(fēng)險(xiǎn)度中；其中如 果步驟c)中得到的MG/G指數(shù)與所述相應(yīng)的對(duì)照比率類似，則認(rèn)為所述受試者未患有癌癥， 也不處于增加的癌癥風(fēng)險(xiǎn)度中。
[0102] 重要地，該方法可以應(yīng)用于任意非糖尿病動(dòng)物或人受試者，優(yōu)選正確地、但甚至是 不正確地經(jīng)治療的糖尿病患者，即具有低于7%的糖化血紅素HbAlc的受試者。
[0103] 如上所述，所述第一次和所述第二生物樣品（致力于分別測(cè)量同一個(gè)體的MG和葡 萄糖水平）優(yōu)選是生物流體樣品，例如選自血液、血清、血漿、尿、腹膜或胸腔積液和腦脊髓 液。在本發(fā)明的方法中，所述第一和第二樣品必須具有相同性質(zhì)（即血液、腹膜或胸腔積液 等）。
[0104] 所述第一和所述第二樣品可以依次采集自所述受試者。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，同 時(shí)采集所述樣品。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一種樣品一分為二，以便測(cè)量同一樣品中 的MG和葡萄糖水平。幾種方法常用于測(cè)定生物樣品中的葡萄糖水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分 知曉如何根據(jù)生物樣品的類型的不同測(cè)量葡萄糖水平。例如，當(dāng)使用血樣時(shí)，可以通過常規(guī) 技術(shù)對(duì)全血、血漿或血清測(cè)量葡萄糖。然而，如果可靠地測(cè)量MG，則必須將樣品保持在4°C。
[0105] 而在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選電或酶葡萄糖測(cè)量技術(shù)。兩種最常用的酶是葡萄糖 氧化酶和己糖激酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過測(cè)量在葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應(yīng)時(shí) 形成的過氧化氫（H202)水平測(cè)量葡萄糖。
[0106] 如上所述測(cè)定生物樣品中的MG水平。
[0107] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在健康個(gè)體或血糖正常的經(jīng)治療的糖尿病受試者的生 物樣品中測(cè)量和根據(jù)其測(cè)量的MG/G指數(shù)優(yōu)選是約0. 01 y moles/g的值，相當(dāng)于MG/G指數(shù) 值，其為得自健康供體的中位MG/G指數(shù)值與得自非癌的血糖正常的經(jīng)治療的糖尿病患者 的中位MG/G指數(shù)值之間的中間值（圖4)。
[0108]4.癌癥患者中的分期、預(yù)后評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)和治療評(píng)價(jià)
[0109] 成像技術(shù)無(wú)法精確地檢測(cè)初始的癌癥狀態(tài)和正確地將癌癥分期成國(guó)際公認(rèn)的4 個(gè)（I-IV)類別。實(shí)際上，臨床腫瘤科醫(yī)生的關(guān)鍵的關(guān)注在于在亞臨床的狀態(tài)期間正確地評(píng) 價(jià)通過生物體的癌癥進(jìn)展和程度。
[0110] 本發(fā)明顯示，在動(dòng)物中，MG的產(chǎn)生水平與腫瘤體積相關(guān)（圖5)，且在患者中，外周 血中的MG產(chǎn)生水平與腫瘤階段（圖3)和治療后的腫瘤響應(yīng)（表3)相關(guān)。
[0111] 本發(fā)明由此涉及用于在癌癥患者中給疾病分期并且根據(jù)生物樣品、優(yōu)選得自所述 患者的血樣中MG的產(chǎn)生水平進(jìn)行預(yù)后評(píng)價(jià)和用于監(jiān)測(cè)癌癥患者中的治療效能的體外方 法，所述癌癥患者無(wú)論是人還是動(dòng)物，該方法包括下述步驟：
[0112] ?為了分期和預(yù)后評(píng)價(jià)：
[0113] a)測(cè)定得自所述患者的初步預(yù)處理生物樣品中的MG產(chǎn)生水平；
[0114] b)將所述預(yù)先處理MG水平與正常MG對(duì)照值進(jìn)行比較；
[0115] c)根據(jù)分期分類的4個(gè)階段分類所述預(yù)處理MG水平；
[0116] ?為了監(jiān)測(cè)抗癌治療的效能：
[0117] a)測(cè)定得自所述患者的第一生物樣品中的初步預(yù)處理MG產(chǎn)生水平；
[0118] b)測(cè)定來(lái)自所述患者的治療后得到的第二生物樣品的第二MG產(chǎn)生水平，
[0119] 其中所述第二樣品在得到第一樣品后的指定時(shí)間得到；
[0120] c)將所述初始和所述第二MG產(chǎn)生水平進(jìn)行比較，其中如果所述第二MG產(chǎn)生水平 高于所述初始MG產(chǎn)生水平，則認(rèn)為所述治療對(duì)所述患者無(wú)效；而如果所述第二MG產(chǎn)生水平 低于所述初始MG產(chǎn)生水平，則認(rèn)為所述治療對(duì)所述患者有效且應(yīng)優(yōu)選繼續(xù)進(jìn)行。
[0121] 這種監(jiān)測(cè)方法可以適用于任意的呈現(xiàn)癌癥的人和動(dòng)物受試者。
[0122] 本發(fā)明的體外方法還可以用于監(jiān)測(cè)給無(wú)癥狀受試者施用的任意預(yù)防性抗癌治療 的治療效能，所述受試者的亞臨床的癌癥已經(jīng)通過使用本方法檢測(cè)到。
[0123] 本發(fā)明的體外方法還可以用于監(jiān)測(cè)給癌癥患者施用的任意預(yù)防性抗癌治療的治 療效能，所述癌癥患者已經(jīng)對(duì)可感覺到的疾病進(jìn)行治療，且對(duì)其而言，需要輔助性的抗癌治 療以便優(yōu)選使用本方法治療殘留的亞臨床疾病。
[0124] 如上所述，第一和第二生物樣品（即分別是處理前和處理后的樣品）優(yōu)選是生物 流體，例如選自全血、血清、血漿、尿、腹膜或胸腔積液和腦脊髓液，則應(yīng)盡可能地相同。在 本方法中，所述第一和第二樣品必須以交錯(cuò)的方式采集，以便所述在樣品采集之間進(jìn)行的 抗-癌治療具有足夠的時(shí)間以發(fā)揮其效能，且根據(jù)本發(fā)明測(cè)量和解釋得到的結(jié)果。更精確 地，如上所示，所述第二生物樣品必須"在第一樣品后指定的時(shí)間"得到，即根據(jù)癌癥生長(zhǎng)倍 增時(shí)間的不同，至少1個(gè)月；優(yōu)選2個(gè)月或3個(gè)月甚至6個(gè)月；且優(yōu)選在已經(jīng)完全給予或在 足夠長(zhǎng)的提供可解釋的結(jié)果的時(shí)間期間啟動(dòng)所述治療后進(jìn)行。
[0125] 本發(fā)明還涉及用于通過所述患者的生物樣品預(yù)測(cè)患有癌癥的患者的存活機(jī)會(huì)的 體外方法，包括下述步驟：
[0126] a)測(cè)定得自所述患者的第一生物樣品中的初始MG產(chǎn)生水平；
[0127] b)測(cè)定得自所述患者的第二生物樣品中的第二MG產(chǎn)生水平；
[0128] 其中所述第二樣品在得到第一樣品后的指定時(shí)間得到；
[0129] c)將所述初始和第二產(chǎn)生水平進(jìn)行比較；
[0130] 其中如果所述第二MG產(chǎn)生水平高于所述初始MG產(chǎn)生水平，則預(yù)測(cè)所述患者具有 短期存活機(jī)會(huì)；其中如果所述第二產(chǎn)生水平低于所述初始產(chǎn)生水平，則預(yù)測(cè)所述患者具有 延長(zhǎng)的存活機(jī)會(huì)。
[0131]該治療效率-預(yù)測(cè)方法可以適用于呈現(xiàn)癌癥的任意的人或動(dòng)物受試者。
[0132] 如上所述，第一和第二生物樣品（即分別是處理前和處理后的樣品）優(yōu)選是生物 流體，例如選自全血、血清、血漿、尿、腹膜或胸腔積液和腦脊髓液，且必須具有相同性質(zhì)。此 外，在本方法中，根據(jù)癌癥生長(zhǎng)倍增時(shí)間的不同，所述第一和第二樣品應(yīng)依次采集，即第一 樣品后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月甚至6個(gè)月，生長(zhǎng)倍增時(shí)機(jī)越短，則時(shí)間間隔應(yīng)越短。
[0133] 優(yōu)選地，該方法對(duì)血樣進(jìn)行。
[0134] 值得注意地，當(dāng)所述第二樣品中的MG產(chǎn)生水平與所述第一樣品中的MG產(chǎn)生水平 類似時(shí)；即如果其比值包含在〇. 7-1. 3中且甚至更優(yōu)選0. 9-1. 1，則例如應(yīng)在1個(gè)月間隔采 集所述第一和第二樣品，如果患者存在生長(zhǎng)、穩(wěn)定或萎縮的癌癥，則無(wú)法精確地預(yù)測(cè)。因此， 必須繼續(xù)進(jìn)行相同治療且隨后數(shù)周或數(shù)個(gè)月重復(fù)測(cè)量以證實(shí)結(jié)果。
[0135]5.惡病質(zhì)的預(yù)測(cè)和早期檢測(cè)
[0136] 評(píng)估惡病質(zhì)在較大百分比的具有癌癥的患者中發(fā)生（尤其是在具有胰腺癌、胃 癌、結(jié)腸癌和肺癌的那些患者中）并且與生活質(zhì)量差和存活時(shí)間減少相關(guān)，與腫瘤負(fù)荷和 存在的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。其臨床特征在于攝食減少和體重減輕，而生物學(xué)特征在于全身炎癥、月旨 質(zhì)代謝和氧化增加、整個(gè)身體蛋白質(zhì)分解和更新增加和碳水化合物代謝受損。在惡病質(zhì)患 者中，碳水化合物代謝改變包括葡糖耐受不良、整個(gè)身體胰島素抵抗、宿主葡萄糖氧化減 少、葡萄糖新生增加和葡萄糖更新和重復(fù)利用增加；在所有這些過程中，胰島素起關(guān)鍵作用 (Tayek, J Am Coll Nutr 1992)〇
[0137] 發(fā)明人測(cè)量MG與BMI相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)MG產(chǎn)生水平與癌癥患者的BMI顯著成負(fù)相 關(guān)性，但與正常受試者的BMI不呈負(fù)相關(guān)性（參見圖7);且在具有低于18的BMI的癌癥患 者中，即在具有前-惡病質(zhì)或惡病質(zhì)綜合征的患者中，MG產(chǎn)生水平比非惡病質(zhì)癌癥患者顯 著增加（表4)。這意味著測(cè)量癌癥患者中的MG可能是預(yù)測(cè)或證實(shí)惡病質(zhì)診斷的有價(jià)值的 工具。此外在惡病質(zhì)癌癥患者中，葡萄糖耐受不良且更具體地是胰島素抵抗是早期的生化 事件，其發(fā)生在體重減輕發(fā)作很早之前（Tayek等人，J Am CollNutr 1992)和減肥患者中， 測(cè)量對(duì)葡萄糖試驗(yàn)?zāi)褪苄缘囊葝u素響應(yīng)可以指示高胰島素/葡萄糖（I/G)指數(shù)情況中的胰 島素抵抗或低I/G指數(shù)情況中的胰島素分泌減少（Rofe等人，Anticancer Res 1994)。因 此，發(fā)明人根據(jù)MG產(chǎn)生水平測(cè)量了癌癥患者和正常受試者中的I/G指數(shù)，并且確立癌癥患 者血液中惡病質(zhì)-相關(guān)的MG對(duì)照值為0. 2 y M，這意味著在0. 2 y M MG值時(shí)，癌癥患者確切 地具有與在健康受試者中測(cè)量的相同的I/G比率，且因此，他們具有相同水平的胰島素抵 抗和胰腺分泌（參見圖8)。
[0138] 因此，本發(fā)明還涉及用于預(yù)測(cè)、檢測(cè)和診斷癌癥受試者或患者中的惡病質(zhì)或 前-惡病質(zhì)的體外方法，包括下述步驟：
[0139] a)測(cè)定得自所述患者的生物樣品中的MG產(chǎn)生水平；
[0140] b)將所述MG產(chǎn)生水平與惡病質(zhì)MG-相關(guān)的對(duì)照值進(jìn)行比較；
[0141] 其中如果所述生物樣品中的MG產(chǎn)生水平高于所述惡病質(zhì)MG-相關(guān)的對(duì)照值，則所 述患者正在進(jìn)入惡病質(zhì)或嚴(yán)重前惡病質(zhì)，因此，預(yù)測(cè)在無(wú)有效的特異性抗惡病質(zhì)治療的存 在下，具有短存活期；
[0142] 而如果所述生物樣品中的MG產(chǎn)生水平低于所述對(duì)照值，則所述患者未進(jìn)入惡病 質(zhì)或嚴(yán)重前惡病質(zhì)，且由此預(yù)測(cè)具有更延長(zhǎng)的存活期。
[0143] 在該方法中，根據(jù)癌癥患者中的胰島素/葡萄糖比率（I/G指數(shù)）的發(fā)展與正常受 試者中I/G指數(shù)的發(fā)展之間的比較確定所述MG對(duì)照值，從而能夠表征稱作"惡病質(zhì)-相關(guān) 的對(duì)照值"的MG產(chǎn)生水平的臨界點(diǎn)，經(jīng)評(píng)估在血液中約為0. 2 y M MG，且高于該值，通過0 胰腺細(xì)胞的胰島素分泌水平不足，這意味著癌癥患者進(jìn)入惡病質(zhì)或嚴(yán)重前惡病質(zhì)。
[0144] 即，在健康受試者中的MG正常對(duì)照值約3倍。
[0145] 此外，這種預(yù)測(cè)方法可以適用于存在癌癥的任意的人或動(dòng)物受試者。
[0146] 甲基乙二醛測(cè)量方法
[0147] 可以通過使用MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法對(duì)實(shí)體組織且更具體地是腫瘤的樣品中的 MG進(jìn)行直接原位分析/檢測(cè)，所述MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法結(jié)合了基質(zhì)輔助激光解吸/電離 (matrix assisted laser desorption/ionization)(MALDI)與飛行時(shí)間質(zhì)譜法（T0F)〇
[0148] 為通過MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法直接原位測(cè)量和分析實(shí)體組織活組織檢查和細(xì)胞 涂片中的MG進(jìn)行的該方法描述在下文中的"實(shí)施例"中。簡(jiǎn)言之，就涉及的實(shí)體組織而言， 在切成12 ym厚度切片之前，首先將實(shí)體組織冷凍在-80°C下并且在低溫恒溫操作過程中 用超純水固定。然后將切片置于專用MALDI平板上，并且用乙醇處理，然后用a-鄰苯二胺 (o-PD)處理。此后，將制品在加濕室內(nèi)在室溫下在黑暗中溫育過夜，然后干燥（使用干燥 器）并且涂敷a -氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA)基質(zhì)溶液。通過分析MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜法 對(duì)2MQX提供的作用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，2個(gè)2MQX分子碎片（一個(gè)為91Da，而另一個(gè)為118Da)是 最佳選擇的MG的標(biāo)志，其在使用MS/MS成像分析后可以用于檢測(cè)和定量實(shí)體組織中的MG。 已經(jīng)設(shè)定了類似的方法并且實(shí)施用于檢測(cè)和測(cè)量細(xì)胞涂片中的胞內(nèi)MG。液體樣品中游離 MG的分析/檢測(cè)可以通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方式進(jìn)行，例如通過使用反相高效液相色譜法 (RP-HPLC)、ELISA試驗(yàn)或其它已經(jīng)提出的方法（參見Ohmori等人，J Chromatogr. 1987 ; McLellan 等人，Anal Biochem 1992 ;Nemet 等人，Clin Biochem 2004 ;Chaplen 等人，Anal Biochem 1996)進(jìn)行。
[0149] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流體生物樣品選自全血、血清、血漿、尿、 腹膜或胸腔積液、腦脊髓液或消化液。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過向血樣中添 加1，2-二氨基苯衍生物、優(yōu)選鄰-苯二胺（o-PD)對(duì)天然存在的游離MG進(jìn)行檢測(cè)。MG與 〇-PD的反應(yīng)實(shí)際上形成喹喔啉類，它們是強(qiáng)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)或它們兩者，易于用RP-HPLC 定量。然而，根據(jù)McLellan等人（McLellan等人，Anal Biocheml992)所述的也通過 RP-HPLC測(cè)量得到的喹喔啉的方法，本發(fā)明還使用1，2-二氨基-4, 5-二甲氧基苯（DMB，也 稱作DDB)。
[0150] 在如下的實(shí)驗(yàn)部分提供了定量全血樣中MG水平的簡(jiǎn)便方法。在該具體的實(shí)施方 案中，通過常規(guī)方式從受試者采集全血樣品，即刻保持在冰上，然后冷凍在-80°C下，直到測(cè) 量MG為止。解凍后，達(dá)到衍生操作的溫度，將樣品保持在4°C，因?yàn)镸G極具反應(yīng)性且不穩(wěn) 定。在第一步中，將