pean Organization for Research and Treatment of Cancer (NCI-E0RTC)的指導原則進行腫瘤標志研宄，其適用于MG的生化 表征和生物特性。NCI-E0RTC指導原則包括有關研宄設計的相關建議、在先推定、患者樣本 特征、測量方法和統(tǒng)計學分析。此外，為了早期檢測和篩查判斷，使用用于生物標志研發(fā)的 NCI Early Detection Research Network(EDRN)的建議。
[0068] 應理解本發(fā)明不限于所述具體實施方案。還必須認為本文所用的術(shù)語的目的僅在 于描述具體的實施方案，而不欲以限定，因為本發(fā)明的范圍僅限于待批權(quán)利要求。
[0069] 發(fā)明詳述
[0070] 甲基乙二醛（MG)-丙酮酸的醛形式，也稱作丙酮醛或2-氧代丙醛，其具有下式： (ch3-co-ch=o或C3H402)-它是唯一的，但是存在于大部分生物系統(tǒng)包括所有哺乳動物細 胞中的遍在分子（Inoue，AdvMicrobPhysio 1995)。它具有高度活性并且是劑量依賴性細胞 毒性代謝物，其主要在糖酵解即呼吸生物體的關鍵代謝步驟過程中產(chǎn)生。
[0071] 主要發(fā)現(xiàn)是，癌細胞與正常細胞的差別在于許多癌細胞在其細胞質(zhì)中主要使用糖 酵解來生成腺苷三磷酸（ATP)，從而提供具有能量的細胞。這種所謂的需氧糖酵解現(xiàn)象涉及 Warburg效應，其為癌細胞代謝的標志（Hsu和Sabatini，Cell 2008)。這種效應目前得到 充分理解，因為已經(jīng)清楚地確立癌細胞與線粒體功能障礙和線粒體DNA(mt DNA)中的突變 相關（Copeland 等人，Cabcer Invest 2002 ;Wallace, Cold Spring HarbSymp Quant Biol 2005)。已經(jīng)證實因線粒體伴隨的羰基應激導致的線粒體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和和mtDNA過度糖 化促使線粒體功能障礙和mtDNA突變（Pun和Murphy, Int J Cell Biol 2012)。此外，在 mtDNA附近dys-功能障礙線粒體導致的自由基過量產(chǎn)生和mtDNA中不存在保護性組蛋白 (Baynes, Ann N Y Acad Sci 2002)可以解釋為何線粒體基因組對羰基應激和氧化性應激 遠比核基因組更敏感，且由此發(fā)生較高比例的突變（Yakes和Van Houten，PNAS 1997)。此 外，已經(jīng)證實癌細胞中的外遺傳和/或誘變改變可以誘導：（1)2型己糖激酶超表達（Goel 等人，J Biol Chem 2003) ;(2)正常胰島素-調(diào)節(jié)的葡萄糖膜受體、尤其是GLUT1、GLUT3和 GLUT5活化（Merral等人，Cell Signal 1993)，導致胞外葡萄糖易于透入癌細胞；和最終 (3)在需氧和厭氧條件下所有糖酵解酶超表達，導致胞內(nèi)葡萄糖被癌細胞主動代謝，而不管 瘤內(nèi)含氧條件如何（Hanahan和Weinberg, Cell 2011)。
[0072] 本發(fā)明涉及如下事實：癌細胞可以特征性地產(chǎn)生顯著高于正常細胞的更高量MG; 使得MG成為癌癥的潛在代謝標志。此外，由于其反應性醛和酮基團，所以證實MG為強電子 受體且由此是極具反應性的化合物，其特征在于化學和生物特性。
[0073] 在許多生物體包括細菌中，MG作為幾種代謝途經(jīng)的副產(chǎn)物形成。它可以由為蘇氨 酸分解代謝中間體3-氨基丙酮和通過脂質(zhì)過氧化形成。然而，最重要的來源是糖酵解，其 中MG通過從二羥丙酮磷酸（DHAP)和甘油醛-3-磷酸（G-3P)的磷酸的非酶消除生成。
[0074] 由于MG具有高度細胞毒性，所以生物體發(fā)生幾種解毒機制，其中之一是乙二醛酶 系統(tǒng)，其在防止細胞發(fā)生親電毒性方面、特別是MG-誘導的損壞糖化起決定性作用。在該過 程中，MG活化乙二醛酶1(GL0-1)，該酶使用還原型谷胱甘肽（GSH)作為輔因子，它將MG轉(zhuǎn) 化成S-D-乳酰谷胱甘肽（S-D-乳酰GSH)，即被乙二醛酶2 (GL0-2)進一步降解成D-乳酸的 代謝中間體（Thornalley, Gen Pharmacol 1996)。值得注意地，已經(jīng)證實GL0-1活性在與正 常組織比較時在許多人癌中增加，包括結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、腎 癌、胰腺癌和胃癌和白血病和黑素瘤，且更具體地為侵害性癌癥（Jones等人，Proteomics 2002;Zhang 等人，Mol Cell Proteomics 2005)。此外，GL0-1 和 GL0-2 超表達與腫瘤中的 多藥抗藥性相關（Sakamoto等人，Blood2000)。然而，GL0-2活性在癌組織中一般低于在正 常組織中，這啟示與正常細胞相比，癌細胞能夠自主地解毒胞內(nèi)MG和恢復正常GSH的可能 性較低。這可以增加羰基應激和氧化性應激，由此根據(jù)胞內(nèi)自由基濃度的不同發(fā)生腫瘤啟 動和進展或細胞凋亡 / 壞死（Irigaray 和 Belpomme, Carcinogenesis 2010)。
[0075] 已經(jīng)描述了 MG作為信號傳導分子的作用。Egyild和Szent-Gy6rgyi首先啟示 GL0-1及其底物MG涉及調(diào)節(jié)細胞分裂（Egyild和Szent-Gydrgyi，PNAS 1966)。更近來， 已經(jīng)啟示MG調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和NF-kB-誘導的報道基因表達的活性（Ranganathan等 人，Gene 1999 ;Laga等人）。此外，已經(jīng)證實晚期糖基化終末化產(chǎn)物（AGEs)形成促使老 化且可能發(fā)生廣泛病理學情況，例如糖尿?。˙rownlee, Nature 2001 ;Brownlee, Diabetes 2005)、動脈高血壓（Wang等人，J Hypertens 2005)、超重/肥胖-相關的脂肪細胞增殖 (Jia 等人，PloS One 2012)、阿爾茨海默病（Smith 等人，PNAS 1994)和癌癥（van Heijst 等人，Ann N Y AcadSci2005)。
[0076] 胞內(nèi)MG形成在血糖過多條件下增加。胞外MG的血液水平異常增加已經(jīng)在具有1 和2型糖尿病的患者中得以證實（Beisswenger等人，Diabetes 1999)，且近來，描述了 MG 可以誘導2型糖尿病中的胰島素抵抗的機制（Ribouley-Chavey等人，Diabetes 2006)。
[0077] -些數(shù)據(jù)清楚地表明，由于其強力電子受體容量，所以MG是強力糖化 (glycating)試劑和最具有反應性的AGE前體（Shinohara等人，J Clin Invest 1998)。 不僅蛋白質(zhì)、而且脂質(zhì)和核酸均對MG導致的糖化敏感（Thornalley，Drug Metabol Drug Interact 2008)〇
[0078] 因此，一方面，認為MG促成癌癥作為有效的誘變劑并且可以負責癌癥發(fā)生和發(fā) 育。另一方面，由于其凋亡前和/或壞死前劑量-相關細胞毒性特性，所以還認為它是抗 癌藥并且認為可在癌動物（Conroy, Ciba Found Symp 1978)和個體（Talukdar等人，Drug Metab Drug Interact2008)中提供一些制癌作用。此外，基于MG的幾種可能的抗腫瘤作用， 已經(jīng)合成了用于治療癌癥的MG-相關化合物，例如化合物甲基乙二醛-雙環(huán)戊基脒基肼；和 化合物米托胍腙即在名稱甲基.-GAG?(NSC-32946)下商品化的甲基乙二醛-雙（丁基 氨基腙）。然而，通過充分的I和II期臨床試驗證實MG和這些合成化合物均不具有實際相 關的抗腫瘤作用。盡管在理解MG全身作用方面取得了進展，但是仍然遠不了解。在大部分 情況中，這歸因于MG主要以加合形式存在，得出由于其極高的糖化特性，所以它結(jié)合胞內(nèi) 和胞外配體（Chaplen等人，PNAS 1998)。此外，使得該問題復雜化的原因在于MG與這些配 體發(fā)生可逆或不可逆相互作用。然而，已經(jīng)證實在得自患有1型或2型糖尿病的患者中的 血樣中可以檢測到自由循環(huán)的MG (Beisswenger等人，Diabetes 1999. ) 〇
[0079]在 1959 年，Lewis、Majane 和 Weinhouse 使用 Neuberg 和 Strauss 的方法清楚地 啟示癌細胞中的MG檢測可以忽略不計（Lewis等人，Cancer Res 1959)。
[0080] 此外，在1978年，Brandt和Siegel推定生物組織中MG的直接測定因活性乙二 醛酶系統(tǒng)而是困難的，且由此提出在血液中施用D-乳酸而不是MG (Brandt和Siegel, Ciba Found Symp 1978)。更近來，根據(jù)有有限的一系列具有確定的惡性腫瘤的研宄患者推定， MG血液水平在乳腺癌和前列腺癌癌癥患者中顯著降低（Kumar, Biswas等人.Biomedical Res2011);而認為MG血液水平在口腔癌前期病變中增加，即認為尚未建立為惡性癌的口 腔損害。實際上，此時并不清楚患者中增加的MG血液水平是否歸因于吸煙和/或酗酒成 癮，得出這些風險因素通常與這樣的受試者相關，且已經(jīng)證實煙草和酒精包含MG(Nagao等 人，Environ Health Perspect 1986);且無論具有所要求確定的癌癥的患者是否預先用抗 癌治療來治療且由此這些患者在采集血樣時是否與確切的臨床和/或生物活性增殖性腫 瘤相關。
[0081] 發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，MG的血液水平在患有確定的進行性癌癥的患者中顯著升 高，而在非代謝活性癌癥中，即在癌前期狀態(tài)甚至原位階段〇癌癥時，MG血液水平并未顯著 升高。實際上，MG血液水平在上皮癌例如頭頸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰 腺癌和其它消化道癌癥和非上皮癌例如白血病、淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤中顯著增加。更精確 地，MG血液水平與腫瘤體積和患有癌癥的患者診斷治療響應相關。MG血液水平越高，則腫 瘤負荷越高。因此且關鍵地，MG水平顯然是有助于腫瘤科醫(yī)生作出決定和治療癌癥患者中 的臨床意乂株遠的生物標志。
[0082]因此，本發(fā)明涉及MG作為臨床有用的生物標志的用途，其用于在具有癌癥的受試 者中進行癌癥早期檢測和診斷并且用于在癌癥患（人或動物）中的預后評價、監(jiān)測和作出 治療決定。由于精確和快速地測量MG血液水平，所以本發(fā)明的診斷方法以極為靈敏的方式 促成疾病監(jiān)測和治療響應評價。最終，由于癌細胞的MG產(chǎn)生涉及這些細胞的基礎和特征 性代謝功能障礙，所以MG作為癌癥生物標志的用途允許檢測許多癌癥，盡管不是所有的癌 癥；這與目前可利用的類型-相關的腫瘤生物標志相反。本發(fā)明的另一個目的是用于早期 檢測和診斷癌癥的試劑盒，其用于給癌癥分期、用于預測癌癥患者的存活機會、用于監(jiān)測抗 癌治療響應和用于預測和早期檢測惡病質(zhì)。
[0083] 本發(fā)明的另一個目的在于MG在早期檢測和診斷具有代謝活性的癌癥中的用途， 其通過使用任意的化學或免疫學體外MG測量方法測量和分析細胞外液、細胞和/或組織樣 品中MG的產(chǎn)生來進行；考慮到優(yōu)選應用MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法或類似技術(shù)。
[0084]1.作為癌細朐產(chǎn)牛的天然瘤內(nèi)牛物標志的MG
[0085] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)癌細胞可以產(chǎn)生和釋放高于正常細胞量的MG，癌細胞在腫瘤內(nèi)、然后 在生物體的胞外隔室中且更具體地在外周血中直接產(chǎn)生和釋放大量MG ;而正常細胞（或炎 癥細胞）在生物體的組織和胞外隔室、更具體地在外周血中不產(chǎn)生和釋放或僅產(chǎn)生或釋放 檢測量較低的MG。
[0086] 這些令人驚奇的結(jié)果已經(jīng)在體外培養(yǎng)物和動物模型中、且更具體地通過使用用于 原位MG腫瘤分析的MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法和在臨床上使用患者得以證實。MG可以直接在 腫瘤組織和腫瘤區(qū)域中檢測到，其中檢測到大部分MG的區(qū)域相當于腫瘤中的活性增殖區(qū) (參見圖2)。此外，癌細胞在培養(yǎng)物產(chǎn)生并且釋放的MG的量取決于培養(yǎng)基中葡萄糖濃度， 即葡萄糖濃度越高，則癌細胞產(chǎn)生的MG越高（參見圖Ibis)，從而證實癌細胞主要使用糖酵 解進行ATP產(chǎn)生，甚至在需氧條件下。此外，發(fā)明人已經(jīng)證實從腫瘤中合成和釋放的MG的 量與腫瘤負荷呈正相關性，即腫瘤體積越高，則外周血中MG的產(chǎn)生水平越高（參見癌癥患 的圖3和動物模型的圖5);而在炎癥和/或免疫感受態(tài)細胞導致的腫瘤排斥的情況中，MG 水平保持極低（參見圖6)。因此，本發(fā)明的一個主要的實施方案在于具有癌癥的受試者的 生物體中腫瘤和/或胞外隔室中檢測到的MG產(chǎn)生水平涉及癌細胞代謝活性的水平，這相當 于受試者患有的腫瘤的增殖活性水平。
[0087]本發(fā)明由此涉及用于早期檢測和診斷癌癥的方法，通過下列方式進行：通過使用 任意化學或免疫學體外MG測量方法測量和分析細胞和/或組織樣品中具有代謝活性的癌 細胞導致的MG原位產(chǎn)生。這些方法包括應用MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜法或類似技術(shù)。
[0088] 因此，本發(fā)明包括MG在通過使用組織活組織檢查測量和分析組織和/或細胞樣品 中MG產(chǎn)生和釋放檢測癌癥的方法中的用途，因為它通常對于任意實體瘤和/經(jīng)或細胞涂片 進行，因為它常用于血癌診斷和監(jiān)測（白血病、淋巴瘤）和/或用于篩查一些實體癌（子宮 頸）和其它癌癥類型。由于從癌細胞中產(chǎn)生和釋放的大部分MG來源于其增加的糖酵解活 性，本發(fā)明還包括用于測定腫瘤的增殖性攻擊性的方法，且由此可以促成癌癥與良性腫瘤 或炎癥過程的區(qū)分，這歸因于癌細胞的代謝活性一般比良性腫瘤或炎癥細胞的代謝活性增 強。
[0089] 2.作為癌細朐在細朐外液中釋放的天然牛物標志的用于在非糖尿病#試者中早 期檢測、診斷和預后評價的MG
[0090] 在本發(fā)明的第二個主要的實施方案中，本發(fā)明包括用于測定所述受試者中存在的 腫瘤的方法，通過下列步驟進行：測量生物體中胞外隔室的生物樣品、更優(yōu)選外周血中的 MG產(chǎn)生水平；并且將測量的MG產(chǎn)生水平與其正常對照值進行比較。
[0091] 本發(fā)明還涉及用于早期檢測、篩查和診斷非糖尿病受試者中的癌癥的體外方法， 包括下述步驟：
[0092] a)測定所述受試者來自細胞外液的生物樣品中的MG產(chǎn)生水平；
[0093] b)將所述MG產(chǎn)生水平與對照值，即與非-癌癥受試者中的MG水平進行比較，其中 如果所述生物樣品中的MG產(chǎn)生水平高于所述對照值，則所述受試者患有癌癥或具有存在 癌癥的高風險度。
[0094] 相反，當所述生物樣品中的MG產(chǎn)生水平處于所述正常對照值范圍內(nèi)時，所述受試 者未患癌癥或具有存在癌癥的低風險度。本發(fā)明能夠在屬于非糖尿病的人或動物受試者 即具有低于7%的糖化血紅素HbAlc水平的受試者中檢測和診斷癌癥。在一個優(yōu)選的實施 方案中，本發(fā)明的診斷