一種血清學(xué)檢測(cè)與定量分析的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣本時(shí)能拮抗?jié)?度依賴性Hook效應(yīng)干擾，并能拓寬靶物質(zhì)定量檢測(cè)范圍的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清學(xué)檢測(cè)以抗原抗體的免疫結(jié)合為依托，實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下，參與反應(yīng)的抗原抗體的 分子特征、免疫復(fù)合物（Immune comlement，1C)的分子大小、數(shù)量多寡及其產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)信號(hào)的 能力（強(qiáng)弱）是血清學(xué)檢測(cè)動(dòng)力學(xué)研宄的主要內(nèi)容。在血清學(xué)檢測(cè)建立的早期，學(xué)者們發(fā) 現(xiàn)在同一的實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)，被檢測(cè)抗原的濃度與實(shí)驗(yàn)信號(hào)的強(qiáng)度呈正相關(guān)（相關(guān)關(guān)系以Y = ax+b描述），并將這一現(xiàn)象用于對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)濃度狀態(tài)的評(píng)價(jià)。隨后研宄者發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)信號(hào) 與靶物質(zhì)濃度的直線相關(guān)只能保持在較為狹小的濃度范圍，由此造成的定量范圍狹窄是當(dāng) 前血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的主要缺陷。超出此濃度范圍即表現(xiàn)出潛帶（包括前帶與后帶）現(xiàn)象， 即由兩者構(gòu)成的函數(shù)曲線在高低濃度端出現(xiàn)定向彎曲。這種曲線偏離的特征又被稱為Hook 效應(yīng)（即鉤狀效應(yīng)）。稍后（上世紀(jì)初葉），Heid elberger等對(duì)這一現(xiàn)象做系統(tǒng)的研宄，發(fā) 現(xiàn)隨著靶物質(zhì)濃度持續(xù)的序貫升高，實(shí)驗(yàn)信號(hào)由低升高，達(dá)一定程度后再由高降低（并最 后可望回歸到閾值狀態(tài)），其函數(shù)圖像在常數(shù)坐標(biāo)上呈偏鋒狀態(tài)序貫升降的雙向曲線狀態(tài)， 在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)上則構(gòu)成與正態(tài)分布類似的序貫升降的雙向曲線狀態(tài)。該曲線狀態(tài)的形成原 因在低濃度端取決于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中被測(cè)定物質(zhì)的濃度，而中、高濃度端則取決于實(shí)驗(yàn)體系中 抗原與抗體兩者的分子比例改變，及由此造成的免疫復(fù)合物分子信號(hào)生成能力的序貫性降 低。由于這一研宄對(duì)免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的闡述至關(guān)重要，后來(lái)者便以發(fā)現(xiàn)者名字命名，將根 據(jù)該結(jié)果繪制的函數(shù)圖像稱之為Heidelberger雙向劑量反應(yīng)曲線（HB雙向劑量反應(yīng)曲線， 簡(jiǎn)稱HB雙向曲線）。
[0003] 需要注意的是，Heidelberger等所處時(shí)代實(shí)驗(yàn)條件十分局限，后來(lái)學(xué)者的研宄亦 多數(shù)局限在對(duì)該結(jié)果的承襲與驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)粗糙且未能排除多種因素干擾，因而使 這項(xiàng)極具理論價(jià)值的研宄未與血清學(xué)檢測(cè)的技術(shù)實(shí)踐發(fā)生關(guān)聯(lián)。
[0004] 綜上所述，在實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展臻于完備的當(dāng)今，Hook效應(yīng)成為制約血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 發(fā)展的主要因素，定量范圍狹窄為廣義的Hook效應(yīng)的一種表現(xiàn)形式。隨著標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù) 在敏感性上的大幅提升，尤其是在某一時(shí)段內(nèi)我國(guó)部分固相免疫實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)方式由經(jīng)典的 二步法轉(zhuǎn)變?yōu)橐徊椒ǎㄈ缫徊椒‥LISA)，并在臨床檢驗(yàn)中大量普及應(yīng)用后，由Hook效應(yīng)引 起的檢驗(yàn)結(jié)果失真甚至錯(cuò)誤便成為一個(gè)較為常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象。它的存在嚴(yán)重妨礙了科研數(shù) 據(jù)的準(zhǔn)確性，并對(duì)臨床診斷、治療及其預(yù)后的判斷造成顯然的負(fù)面影響。如果發(fā)生于某些特 殊臨床檢測(cè)如采用一步法ELISA或化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行血清HBsAg篩選，則可造成50%或以 上臨床標(biāo)本的定量結(jié)果偏離真值，部分強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)值降低或顯著降低，甚至導(dǎo)致個(gè)別具 有高度傳染性的強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本出現(xiàn)假陰性結(jié)果。這種漏檢一旦發(fā)生在獻(xiàn)血員篩選，則勢(shì)必導(dǎo) 致輸血相關(guān)性肝炎的嚴(yán)重臨床事件。
[0005] 二步法免疫（如二步法ELISA等）作為對(duì)Hook效應(yīng)拮抗的一種方式，能將一步法 結(jié)果中低信號(hào)高值及假陰性結(jié)果轉(zhuǎn)換成高信號(hào)溢值狀態(tài)，但不能改變?cè)摬糠謽?biāo)本定量結(jié)果 偏離真值的狀態(tài)，其定量范圍亦未得到拓展。
[0006] 上世紀(jì)九十年代初，有學(xué)者對(duì)血清學(xué)檢測(cè)中免疫反應(yīng)時(shí)間與實(shí)驗(yàn)信號(hào)消長(zhǎng)進(jìn)行 研宄，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)信號(hào)強(qiáng)度增加，在相同間隔時(shí)段內(nèi)檢測(cè)，不同濃度標(biāo) 本實(shí)驗(yàn)信號(hào)增長(zhǎng)的幅度不同，研宄者據(jù)此找出能界定Hook效應(yīng)發(fā)生時(shí)的最佳信號(hào)增長(zhǎng)比 率，以其做界點(diǎn)判定被測(cè)定標(biāo)本有否發(fā)生Hook效應(yīng)，并對(duì)出現(xiàn)Hook效應(yīng)者進(jìn)行稀釋重測(cè)， 取得理想的結(jié)果。該方法隨后作為判定并矯正Hook效應(yīng)的措施進(jìn)入商業(yè)化臨床應(yīng)用，取得 了較好的社會(huì)效益；Kornel Papik等對(duì)上述免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行了進(jìn)一步研宄，在進(jìn) 一步系統(tǒng)印證上述現(xiàn)象的同時(shí)，提出一項(xiàng)拮抗Hook效應(yīng)并同時(shí)拓展定量分析范圍的新方 法，將其用于血清鐵蛋白的檢測(cè)，取得了十分理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；國(guó)內(nèi)劉忠民等（2000年）采 用相同的實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行血清IgG檢測(cè)，在進(jìn)一步闡述HB雙向劑量反應(yīng)曲線特征的同時(shí)，還 發(fā)現(xiàn)與Kornel Papik研宄雷同的實(shí)驗(yàn)信號(hào)依時(shí)性改變可同時(shí)出現(xiàn)在抗原過(guò)剩及抗體過(guò)剩 等兩種實(shí)驗(yàn)狀態(tài)下，從而使后來(lái)者有理由推斷此類Hook效應(yīng)拮抗方法可望同時(shí)用于抗原 與抗體兩者的檢測(cè)。
[0007] 上述研宄結(jié)果表明，HB雙向劑量反應(yīng)曲線是一個(gè)抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中客觀存在的 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，盡管在良好的試驗(yàn)狀態(tài)下，其曲線的各個(gè)部分均不同程度地具備穩(wěn)定的劑量相 關(guān)特征，但既往研宄者一直未能將其用于血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果的定量參比分析。其原因可能包 括①既往研宄者對(duì)HB雙向劑量反應(yīng)曲線的特征缺乏深入認(rèn)識(shí)；②既往沿用的函數(shù)分析方 式（直線回歸，Y = ax+b)不能進(jìn)行Hook現(xiàn)象處理，而簡(jiǎn)單的曲線回歸難以在整體曲線上 達(dá)成定量分析所需要的實(shí)驗(yàn)精度；③既往多數(shù)實(shí)驗(yàn)方法因?qū)嶒?yàn)過(guò)程、試劑、儀器等原因難以 呈現(xiàn)適宜參比的曲線狀態(tài)；④如何在雙向反應(yīng)曲線上與同一實(shí)驗(yàn)信號(hào)（Y)對(duì)應(yīng)的兩個(gè)靶物 質(zhì)濃度對(duì)映值中確認(rèn)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的靶物質(zhì)濃度真值；以及⑤如何矯正HB雙向曲線圍頂點(diǎn)區(qū) 段因頂點(diǎn)效應(yīng)而導(dǎo)致的局部定量分析精度明顯下降。這些技術(shù)難點(diǎn)的解決是推動(dòng)HB雙向 曲線由理論走向?qū)嶋H應(yīng)用的前提。
[0008] 均相免疫（包括由微球吸附技術(shù)參與的類均相免疫）實(shí)驗(yàn)指全部的反應(yīng)與結(jié)果 的觀察均在同一個(gè)液相環(huán)境中進(jìn)行的免疫學(xué)檢測(cè)方法，操作過(guò)程比其它類型的血清學(xué)實(shí)驗(yàn) 簡(jiǎn)潔。免疫沉淀（與免疫凝集）實(shí)驗(yàn)，光激發(fā)化學(xué)發(fā)光免疫分析實(shí)驗(yàn)（Light Initiated chemiluminescence assay，LiCA)，以及均相酶免疫分析是這類方法的主要代表，亦是目前 已經(jīng)（或正在）商品化的主要均相免疫技術(shù)。例如我國(guó)近年推出的血清HBsAg檢測(cè)光激發(fā) 化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)，具有很高的敏感性、便捷性與穩(wěn)定性，定量檢測(cè)范圍等諸多實(shí)驗(yàn)品質(zhì)亦與電 化學(xué)發(fā)光等優(yōu)秀檢測(cè)技術(shù)相當(dāng)，但因受Hook效應(yīng)影響較固相免疫實(shí)驗(yàn)方法為甚，且不存在 部分糾正Hook效應(yīng)的過(guò)渡性措施（如固相免疫試驗(yàn)中的二步法免疫實(shí)驗(yàn)等）而造成大量 無(wú)法定量與錯(cuò)誤定量結(jié)果，不僅遠(yuǎn)未能占有應(yīng)得的市場(chǎng)份額，反而與一步法ELISA等傳統(tǒng) 技術(shù)一起被排除于獻(xiàn)血員篩選等規(guī)?；袌?chǎng)應(yīng)用的行列。
[0009] 因此，本領(lǐng)域需要一種旨在糾正Hooks效應(yīng)并拓展血清學(xué)檢測(cè)定量范圍的簡(jiǎn)便易 行的血清學(xué)檢測(cè)分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提出一種血清學(xué)定量檢測(cè)及分析新方法。該方法以均相免疫或類 均相免疫技術(shù)為依托，能全方位保持原有血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)特征，可用于抗原或抗體的檢 測(cè)，能拮抗?jié)舛纫蕾囆訦ook效應(yīng)干擾，并極大拓寬靶物質(zhì)定量檢測(cè)范圍。
[0011] 上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 一種旨在糾正Hook效應(yīng)并拓展血清學(xué)檢測(cè)定量范圍的血清學(xué)檢測(cè)方法，包括如 下步驟：
[0013] 1、實(shí)驗(yàn)過(guò)程：在存在標(biāo)記與未標(biāo)記對(duì)應(yīng)免疫反應(yīng)試劑（抗原及抗體）及信號(hào)生成 相關(guān)試劑的實(shí)驗(yàn)孔（管，或其他載體容器）中分別加入?yún)⒈葮?biāo)準(zhǔn)品、擬合樣品、陰陽(yáng)性對(duì)照 或待測(cè)標(biāo)本，混合后放置，以使其發(fā)生免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生可供測(cè)定的實(shí)驗(yàn)信號(hào)，于發(fā)生免疫 反應(yīng)的T1、T2時(shí)點(diǎn)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)信號(hào)S1、S2的檢測(cè)；將其輸入專項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)進(jìn)行處理， 并按照實(shí)驗(yàn)者指令輸出實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0014] 2、函數(shù)關(guān)系的擬合：
[0015] 1)同上實(shí)驗(yàn)條件下，采用超過(guò)100個(gè)濃度點(diǎn)樣本，濃度范圍設(shè)定涵蓋HB雙向曲線 有效分析區(qū)段圖像，濃度區(qū)間設(shè)定為質(zhì)點(diǎn)間間隔0.025- 0.10橫軸（X軸）讀數(shù)距離，對(duì)此 參比標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10次或以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取每個(gè)濃度點(diǎn)各次檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)信號(hào)平均值作為該 點(diǎn)對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)信號(hào)進(jìn)行高密度函數(shù)擬合分析；
[0016] 2)將所生成的實(shí)驗(yàn)信號(hào)輸入人工智能分析系統(tǒng)，人工智能分析系統(tǒng)的后臺(tái)路徑概 況：
[0017] ①輸入T1及T2兩時(shí)點(diǎn)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)信號(hào)值S1及S2;
[0018] ②計(jì)算出受檢標(biāo)本T1及T2時(shí)點(diǎn)S1與S2的比值，包括實(shí)驗(yàn)信號(hào)飽和度等；將實(shí) 驗(yàn)信號(hào)飽和度轉(zhuǎn)換成飽和度指數(shù)（Signal Saturation degree index，SSDI)，轉(zhuǎn)換方法為 (S1/S2) X 100Xe，e 為轉(zhuǎn)換系數(shù)；
[0019] ③在平面半對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖像上，根據(jù)系列參比標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定所獲取的實(shí)驗(yàn)信號(hào)SI及 S2,分別繪制出S1及S2兩條HeidelBerger雙向劑量反應(yīng)曲線，并將飽和度指數(shù)按照各 自對(duì)應(yīng)靶物質(zhì)濃度依次標(biāo)繪到前述半對(duì)數(shù)函數(shù)圖像中，繪制出相應(yīng)的信號(hào)飽和度指數(shù)曲線 SSI，此三條曲線構(gòu)成復(fù)合HB雙向劑量反應(yīng)曲線圖像分析體系，其中Y軸為實(shí)驗(yàn)信號(hào)強(qiáng)度或 SSDI，X軸為靶物質(zhì)濃度的對(duì)數(shù)數(shù)值；
[0020] ④采用擬合法確證HB雙向曲線中函數(shù)x與y (以及SSDI)的關(guān)系。
[0021] 通過(guò)擬合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HB雙向劑量反應(yīng)曲線圖像中各HB雙向曲線上的實(shí)測(cè)點(diǎn)（y) 與其所對(duì)應(yīng)的函數(shù)值（x)之間的關(guān)系可采用以下公式表述：
[0022]
以合效果R~2彡0? 99
[0023] 其中x:為靶物質(zhì)濃度的自然對(duì)數(shù)；a:修正參數(shù)；b:對(duì)數(shù)均值；c:標(biāo)準(zhǔn)差；f(x) =實(shí)驗(yàn)信號(hào)（y);
[0024] HB雙向劑量反應(yīng)曲線圖像中信號(hào)飽和度指數(shù)曲線（SSI)上各實(shí)測(cè)點(diǎn)（SSDI，限兩 HB雙向曲線圖像內(nèi)側(cè)點(diǎn)值）及其與所對(duì)應(yīng)的函數(shù)值（x)之間的關(guān)系可以采用以下公式表 述。
[0025] f (x) = a+b X x，擬合效果 R~2 多 0? 95
[0026] 其中x:為靶物質(zhì)濃度的自然對(duì)數(shù)；a:截距（當(dāng)x =0時(shí)，Y的取值本底信號(hào)的大 ?。籦 :斜率（X變化一個(gè)單位時(shí)Y的增減量）；
[0027]y=f(x) = SSDI = (S1/S2) X 100 Xe(e為轉(zhuǎn)換系數(shù)）；
[0028] 3、（擬合）函數(shù)圖像分析界點(diǎn)的確定
[0029] 1)計(jì)算兩HB雙向曲線的頂點(diǎn)P1及P2,公式：P(y) =f(x) = y，其中，y =b(見(jiàn) 前曲線回歸公式），即實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)模擬出的模型參數(shù)的對(duì)數(shù)均值，為PI或P2在頂點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃 度對(duì)數(shù)值；
[0030] 2)確認(rèn)兩頂點(diǎn)在X軸讀數(shù)差值的中點(diǎn)Pe (公式：Pe (x) = (PI (x) +P2 (x)) /2)，經(jīng) Pe點(diǎn)對(duì)X軸做垂線M，并與S1、S2及SSI三曲線分別相交于A1、A2及Q，分別算出三者的實(shí) 驗(yàn)信號(hào)（y，或SSDI)值；
[0031] 3)編程以建立以復(fù)合HB雙向劑量反應(yīng)曲線為參比對(duì)象的血清學(xué)均相免疫檢測(cè)定 量分析系統(tǒng)；
[0032] 4、濃度參比標(biāo)準(zhǔn)品及設(shè)定
[0033] 設(shè)定當(dāng)次常規(guī)參比標(biāo)準(zhǔn)品，以步驟2建立的HB雙向劑量反應(yīng)曲線為基礎(chǔ)，其濃度 以大致達(dá)成雙向曲線的下述線性區(qū)位為目標(biāo)，具體設(shè)定包括：①本底核對(duì)參比，0靶物質(zhì)， 閾值設(shè)定參照；②敏感性控制參比，低濃度端，曲線正態(tài)分布的三階導(dǎo)數(shù)的圍起點(diǎn)處；③線 性狀態(tài)控制，左右拐點(diǎn)附近，正態(tài)分布曲線的圍二階導(dǎo)數(shù)起點(diǎn)處；④Y值高點(diǎn)控制，正態(tài)分 布曲線的圍一階導(dǎo)數(shù)起點(diǎn)（即圍頂點(diǎn)）處；⑤類Hook效應(yīng)控制點(diǎn)設(shè)定，其濃度設(shè)定以所產(chǎn) 生實(shí)驗(yàn)信號(hào)在強(qiáng)度上與敏感性控制參比品所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)信號(hào)相對(duì)應(yīng)；
[0034] 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
[0035] 1)通過(guò)濃度參比標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)、數(shù)據(jù)的輸入、調(diào)出適宜當(dāng)次結(jié)果分析，即調(diào)出經(jīng)修正 的前述步驟2、3建立的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)；通過(guò)A1界點(diǎn)可將S1雙向曲線不對(duì)稱地分為左右兩 部分，頂點(diǎn)P1位于界點(diǎn)A1的左側(cè)，其中右側(cè)高x值區(qū)段為實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀區(qū)段；通過(guò)A2界 點(diǎn)可將S2雙向曲線不對(duì)稱地分為左右兩部分，頂點(diǎn)P2位于界點(diǎn)A2的右側(cè)，其中左側(cè)低x 值區(qū)段為實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀區(qū)段；通過(guò)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本序號(hào)的輸入鎖定待分析實(shí)驗(yàn)標(biāo)本實(shí)測(cè)與計(jì)算數(shù) 據(jù)；通過(guò)測(cè)定標(biāo)本SSDI與Q值的比較確定待測(cè)標(biāo)本參比分析的曲線及相應(yīng)區(qū)段，即當(dāng)測(cè)定 標(biāo)本的SSDI大于Q值時(shí)，根據(jù)其T2時(shí)點(diǎn)測(cè)值y在S2曲線的左側(cè)區(qū)段查讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果；當(dāng)測(cè) 定標(biāo)本SSDI小于Q值時(shí)，根據(jù)其T1時(shí)點(diǎn)測(cè)值y在S1曲線的右側(cè)區(qū)段查讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0036] 2)采用輸入?yún)⒈葮?biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)數(shù)據(jù)所調(diào)出的前述步驟2、3建立的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中 的閾值對(duì)上述5、1)項(xiàng)分析結(jié)果做進(jìn)一步分析，其實(shí)驗(yàn)標(biāo)本S2測(cè)值小于對(duì)應(yīng)曲線閾值（陰 性孔均值乘以2.1倍）者為陰性；
[0037] 3)采用輸入?yún)⒈葮?biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)數(shù)據(jù)所調(diào)出的前述步驟2、3建立的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中 的類Hook效應(yīng)控制點(diǎn)對(duì)上述步驟5、1)項(xiàng)分析結(jié)果做進(jìn)一步分析，其實(shí)驗(yàn)標(biāo)本S1測(cè)值小 于對(duì)應(yīng)曲線類Hook效應(yīng)控制點(diǎn)參比信號(hào)者為存在類Hook效應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，該標(biāo)本靶 物質(zhì)濃度高于類Hook效應(yīng)控制點(diǎn)，其結(jié)果以定性方式報(bào)道為超高濃度陽(yáng)