檢測孕馬尿中的雌酮硫酸鈉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測孕馬尿中的雌酮硫酸鈉的方法,尤其是一種基于分子印跡的電化學(xué)傳感器用于檢測孕馬尿中的雌酮硫酸鈉的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)合雌激素是從孕馬尿中提取的一種天然混合雌激素,臨床上主要用于激素替代療法,緩解因雌激素不足引發(fā)的臨床癥狀,治療和預(yù)防女性生理或人工絕經(jīng)后出現(xiàn)的更年期綜合征,預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、冠心病以及老年癡呆癥。我國新疆伊犁地區(qū)是中國馬匹資源最為集中的地區(qū),孕馬尿中富含多種雌激素,主要以硫酸鈉鹽結(jié)合形式存在,其中以雌酮硫酸鈉、馬烯雌酮硫酸鈉及17 α -雙氫馬烯雌酮硫酸鈉為主,占總結(jié)合雌激素的90%以上。
[0003]目前,檢測孕馬尿中雌激素含量的方法主要應(yīng)用的是高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,HPLC)和氣相色譜法(gas chromatography,GC),這兩種方法得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。但由于HPLC法和GC法需要特定的儀器設(shè)備、樣品的前處理復(fù)雜及需要一定的檢測時間,費力耗時,儀器昂貴,而且需要專門的技術(shù)人員操作,且操作復(fù)雜,不能用于現(xiàn)場監(jiān)控,分析速度慢不適用于大量篩選。而隨孕馬尿產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大,采集規(guī)模也在不斷的擴(kuò)大、需檢測的樣本也迅速增長,色譜檢測法已不適應(yīng)新的采集、運輸模式的建立。因而建立簡單、快速、適合大樣本篩選,適合野外檢測、靈敏度高的檢測方法非常必要和有極高的實用價值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是針對以上問題提供一種基于分子印跡的電化學(xué)傳感器用于檢測孕馬尿中的雌酮硫酸鈉的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]本發(fā)明其特點在于:
[0007]第一步:選用一種基于分子印跡電化學(xué)傳感器,所述的一種基于分子印跡電化學(xué)傳感器為:分子印跡聚合物修飾的玻碳電極(glass carbon electrode,GCE)、分子印跡聚合物修飾的金電極(gold electrode, GE)、分子印跡聚合物修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極(screen-printed carbon electrode,SPCE)中的一種;將所述的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP)修飾的電化學(xué)傳感器以雌酮硫酸鈉為模板分子;
[0008]第二步:進(jìn)行上述分子印跡聚合物修飾的電化學(xué)傳感器的制備流程
[0009]A、先以所選用的分子印跡電化學(xué)傳感器所選擇的一種電極為工作電極,置于含雌酮硫酸鈉和功能單體的混合溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描;
[0010]B、再將經(jīng)上述步驟處理后的電極置于濃度范圍為0.1?0.5mol/L的稀硫酸溶液、濃度范圍為0.05?0.2mol/L為稀氫氧化鈉溶液、pH值范圍為3.0?8.0的醋酸鹽緩沖液的一種中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描;
[0011]進(jìn)行上述的A步循環(huán)伏安法掃描時的電壓范圍為-1.0?1.2V ;
[0012]進(jìn)行上述的B步循環(huán)伏安法掃描時的電壓范圍為-1.5?1.5V ;
[0013]在A步中功能單體可選用溴酚藍(lán)、間苯二酚、鄰氨基苯酚、多巴胺、鄰苯二胺和吡咯中的一種;
[0014]所述的雌酮硫酸鈉與功能單體的摩爾比為1: 2?5;
[0015]將A步中所述混合溶液由雌酮硫酸鈉和功能單體分別用相應(yīng)溶劑溶解后,再等體積混合得到,雌酮硫酸鈉可采用蒸餾水溶解,功能單體可采用醋酸鹽緩沖溶液溶解;
[0016]第三步:將經(jīng)上述處理后的分子印跡電化學(xué)傳感器用于孕馬尿中進(jìn)行檢測雌酮硫酸鈉。
[0017]上述的分子印跡電化學(xué)傳感器亦可為分子印跡聚合物修飾的碳糊電極(carbonpaste electrode, CPE),其制備流程按下述過程進(jìn)行;
[0018]取雌酮硫酸鈉:丙烯胺1: 2?5,均勻分散于乙腈-水3: I溶劑中,超聲15min,靜置2?Sh使模板分子與丙烯胺充分作用,加乙二醇二甲基丙烯酸酯:偶氮二異丁腈75: I?3,超聲處理,待充分溶解混合后分兩份,通氮氣除氧15min后密封,一份置于50?60°C恒溫反應(yīng)24h,另一份以240nm的波長下紫外照射15?90min,反應(yīng)生成白色塊狀聚合物,干燥得聚合物,研磨過200目篩,制得雌酮硫酸鈉分子印跡聚合物;
[0019]所得聚合物用甲醇-乙酸8?9: 1(質(zhì)量比m: m),作為洗脫劑以3?5mL/min回流速度提取24?26h,后用甲醇沖洗數(shù)次,50?60°C干燥,保存?zhèn)溆茫?br>[0020]將已制備的雌酮硫酸鈉分子印跡聚合物和光譜純石墨粉以1: 4?5的比例混合均勻;然后,再加入適量的石蠟油作為混合劑,混合比例為:石墨粉+雌酮硫酸鈉分子印跡聚合物:石蠟油=85: 15;最后,在瑪瑙研缽中研磨均勾,即得到可以使用的碳糊,將碳糊填充內(nèi)徑為3mm的聚四氟乙烯材料電極管中,在碳糊的另一端銅棒作為導(dǎo)體,將管中碳糊壓實,擠出表層碳糊,重復(fù)進(jìn)行壓實過程,即可得到分子印跡聚合物修飾的碳糊電極;
[0021]新構(gòu)筑的工作電極需要在稱量紙上進(jìn)行拋光,得到光亮平整的表面。在使用之前,CPE進(jìn)行活化處理,采用循環(huán)伏安法在0.5?1.3V的電位于0.2mol/L的NaOH溶液中掃描數(shù)圈,將處理后的分子印跡聚合物修飾的碳糊電極用于孕馬尿中進(jìn)行檢測雌酮硫酸鈉。
[0022]MIP是一種人工合成的對目標(biāo)分子具有預(yù)定選擇性的聚合物材料,所得到的MIP與目標(biāo)分子有“鎖與鑰”的對應(yīng)識別關(guān)系,所以具有高選擇性;采用MIP作為電化學(xué)傳感器的修飾材料,可獲得既具有高靈敏度,又具有高選擇性的傳感器;本發(fā)明采用分子印跡電化學(xué)傳感器檢測孕馬尿中的雌酮硫酸鈉,表現(xiàn)出高度的特異性,又具有低成本、易于小型化、自動化、檢出限低,且制備過程簡單等特點,得到廣泛應(yīng)用;而想要獲得具有預(yù)定選擇性能的傳感器,則需要進(jìn)一步對電極進(jìn)行修飾?;诖仆蛩徕c分子印跡電化學(xué)傳感器的制備,考察了聚合單體的種類、聚合液的PH值,功能單體與模板分子的比例等影響分子印跡傳感器性能的因素,優(yōu)化出最佳的制備條件,通過合適的洗脫方法制備出具有識別性能的分子印跡傳感器,進(jìn)而通過電化學(xué)分析方法實現(xiàn)雌酮硫酸鈉的快速分析;與現(xiàn)有的HPLC法和GC法相比,本發(fā)明的雌酮硫酸鈉分子印跡聚合物用于修飾傳感器,可直接作為檢測雌酮硫酸鈉的傳感器,對雌酮硫酸鈉的檢測不依賴于大型儀器,檢測時間短并且操作過程簡單,其檢測結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。
【具體實施方式】
[0023]實施例1:第一步:選用分子印跡聚合物修飾的玻碳電極作為分子印跡電化學(xué)傳感器,將所述的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極以雌酮硫酸鈉為模板分子;
[0024]第二步:上述分子印跡聚合物修飾的電化學(xué)傳感器的制備流程
[0025]A、先以所選用的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極為工作電極,置于含雌酮硫酸鈉和功能單體的混合溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描;
[0026]將20mL雌酮硫酸鈉溶液:雌酮硫酸鈉溶于蒸餾水,濃度為2X10 3mol/L與20mL溴酚藍(lán)溶液:溴酚藍(lán)溶解在pH = 6.0的醋酸鹽緩沖溶液中,濃度為4X10 3mol/L,混合,向溶液中通氮氣5min后,采用三電極體系,以飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲為對電極,玻碳電極為工作電極,將各電極插入聚合液中,采用循環(huán)伏安法,在O?0.8V的電位范圍內(nèi),以50mV/s的掃描速度連續(xù)循環(huán)掃描30圈,聚合物沉積在玻碳電極表面;
[0027]B、再將經(jīng)上述步驟處理后的電極置于pH值為3.0的醋酸鹽緩沖溶液中,在一1.0?1.0V的電位范圍內(nèi)采用循環(huán)伏安法掃描數(shù)圈,除去模板分子雌酮硫酸鈉,得到分子印跡聚合物修飾的玻碳電極(MIP/GCE);
[0028]第三步:最后再將經(jīng)上述處理后的分子印跡電化學(xué)傳感器用于孕馬尿中檢測雌酮硫酸鈉,采集孕期為3個月的孕馬尿樣品進(jìn)行檢測,得其雌酮硫酸鈉含量為35.7 μ g/mL。
[0029]實施例2:第一步:選用分子印跡聚合物修飾的玻碳電極作為分子印跡電化學(xué)傳感器,將所述的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極以雌酮硫酸鈉為模板分子;
[0030]第二步:上述分子印跡聚合物修飾的電化學(xué)傳感器的制備流程
[0031]A、先以所選用的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極為工作電極,置于含雌酮硫酸鈉和功能單體的混合溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描;
[0032]將20mL雌酮硫酸鈉溶液:雌酮硫酸鈉溶于蒸餾水,濃度為2X10 3mol/L與20mL溴酚藍(lán)溶液:溴酚藍(lán)溶解在pH = 4.0的醋酸鹽緩沖溶液中,濃度為6X10 3mol/L,混合,向溶液中通氮氣5min后,采用三電極體系,以飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲為對電極,玻碳電極為工作電極,將各電極插入聚合液中,采用循環(huán)伏安法,在-1.0?1.8V的電位范圍內(nèi),以50mV/s的掃描速度連續(xù)循環(huán)掃描20圈,聚合物沉積在玻碳電極表面;
[0033]B、再將經(jīng)上述步驟處理后的電極置于0.2mol/L H2SO4溶液中,在-1.0?1.0V的電位范圍內(nèi)采用循環(huán)伏安法掃描數(shù)圈,除去模板分子雌酮硫酸鈉,得到分子印跡聚合物修飾的玻碳電極(MIP/GCE);
[0034]第三步:最后再將經(jīng)上述處理后的分子印跡電化學(xué)傳感器用于孕馬尿中檢測雌酮硫酸鈉,采集孕期為6個月的孕馬尿樣品進(jìn)行檢測,得其雌酮硫酸鈉含量為54.9 μ g/mL。
[0035]實施例3:第一步:選用分子印跡聚合物修飾的玻碳電極作為分子印跡電化學(xué)傳感器,將所述的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極以雌酮硫酸鈉為模板分子;
[0036]第二步:上述分子印跡聚合物修飾的電化學(xué)傳感器的制備流程
[0037]A、先以所選用的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極為工作電極,置于含雌酮硫酸鈉和功能單體的混合溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描;
[0038]將20mL雌酮硫酸鈉溶液:雌酮硫酸鈉溶于蒸餾水,濃度為2X10 3mol/L與20mL溴酚藍(lán)溶液:溴酚藍(lán)溶解在pH = 6.0的醋酸鹽緩沖溶液中,濃度為8X10 3mol/L,混合,向溶液中通氮氣5min后,采用三電極體系,以飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲為對電極,玻碳電極為工作電極,將各電極插入聚合液中,采用循環(huán)伏安法,在-1.5?1.8V的電位范圍內(nèi),以50mV/s的掃描速度連續(xù)循環(huán)掃描15圈,聚合物沉積在玻碳電極表面;
[0039]B、再將經(jīng)上述步驟處理后的電極置于0.05mol/LNa0H溶液中,在-0.5?0.5V的電位范圍內(nèi)采用循環(huán)伏安法掃描數(shù)圈,除去模板分子雌酮硫酸鈉,得到分子印跡聚合物修飾的玻碳電極(MIP/GCE);
[0040]第三步:最后再將經(jīng)上述處理后的分子印跡電化學(xué)傳感器用于孕馬尿中檢測雌酮硫酸鈉,采集孕期為2個月的孕馬尿樣品進(jìn)行檢測,得其雌酮硫酸鈉含量為20.1 μ g/mL。
[0041]實施例4:第一步:選用分子印跡聚合物修飾的玻碳電極作為分子印跡電化學(xué)傳感器,將所述的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極以雌酮硫酸鈉為模板分子;
[0042]第二步:上述分子印跡聚合物修飾的電化學(xué)傳感器的制備流程
[0043]A、先以所選用的分子印跡聚合物修飾的玻碳電極為工作電極,置于含雌酮硫酸鈉和功能單體的混合溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描;
[0044]將20mL雌酮硫酸鈉溶液:雌酮硫酸鈉溶