胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物、用途及其檢測(cè)芯片和檢測(cè)裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物、用途及其 檢測(cè)芯片和檢測(cè)裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為 起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。通常發(fā)病后的患者，5年生存率〈1 %，是預(yù)后最差的惡性腫瘤 之一。
[0003] 導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后生存率如此低的重要原因在于胰腺癌早期無任何癥狀，難以在胰 腺癌發(fā)病潛伏期或者初期被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從而貽誤最佳的治療時(shí)間。主要難以被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)是 因?yàn)樵诎l(fā)病初期無任何癥狀，而且目前所能采用的檢測(cè)精確度最好的CA19-9、CEA、CA242 胰腺癌檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，有一定的陽性率，且不具備高特異性。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示， 采用上述標(biāo)記物在胰腺癌孕育期檢測(cè)（癌變之前）敏感性較低，如發(fā)病前1年，有68%的敏 感性，發(fā)病前兩年，敏感性為53%。而采用其他的常規(guī)臨床技術(shù)檢測(cè)，如B超、CT、MRI、ERCP、 PTCD、血管造影、腹腔鏡等檢查到發(fā)現(xiàn)癌變時(shí)已處于癌癥中晚期，極大耽誤了診斷和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能夠準(zhǔn)確性和特異性 更好的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物、用途及其檢測(cè)芯片和檢測(cè)裝置。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0006] -種胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物，包括在人體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的CRP、 ICAM-U0PG 和 CA 19-9 〇
[0007] 本發(fā)明的上述胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物通過"差減法"的方式篩選得到，即以正常樣 本作為對(duì)照，從癌變樣本中扣除正常樣本中全蛋白，多出的部分既是癌癥所特有的調(diào)節(jié)性 蛋白；驗(yàn)證表明其參與了胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程，為可信的胰腺癌早期生物標(biāo)記物，相比現(xiàn)有 的檢測(cè)標(biāo)記物具有更高的特異性和靈敏性。
[0008] 在上述蛋白生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步還提出上述胰腺癌蛋白生物標(biāo)記 物在胰腺癌檢測(cè)裝置中的應(yīng)用。
[0009] 采用本發(fā)明的該胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物作為基礎(chǔ)的胰腺癌檢測(cè)裝置，檢測(cè)的標(biāo)的 為差異分析的方法篩選到以上標(biāo)志蛋白，相比現(xiàn)有的檢測(cè)標(biāo)記物具有更高的特異性和靈敏 性。
[0010] 以及，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測(cè)芯片，包括固相基 質(zhì)，以及固定于該固相基質(zhì)上的CRP單抗、ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9單抗。
[0011] 同時(shí)本發(fā)明還提出一種包括上述胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測(cè)芯片的檢測(cè)裝置。
[0012] 本發(fā)明的檢測(cè)芯片和檢測(cè)裝置用CRP、ICAM_1、0PG和CA19-9進(jìn)行免疫制備的特異 性CRP單抗、ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9單抗為基礎(chǔ)，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合從 而對(duì)上述生物標(biāo)記蛋白進(jìn)行檢測(cè)，具有比較高的準(zhǔn)確性和特異性。
【附圖說明】
[0013] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)芯片中固相基質(zhì)上的點(diǎn)樣孔的排布示意圖；
[0015] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測(cè)芯片封裝之后的整體形狀示 意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0017] 本發(fā)明提出一種胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物，包括CRP(C反應(yīng)蛋白）、ICAM-I (細(xì)胞間 黏附分子-I)、OPG (骨保護(hù)素）和CA19-9 (糖鏈抗原19-9)。
[0018] 本發(fā)明根據(jù)對(duì)胰腺癌的檢測(cè)和檢查，提出上述生物標(biāo)記物，相比現(xiàn)有臨床分析的 手段和通常用的CA19-9、CEA、CA242胰腺癌檢測(cè)標(biāo)記物，本發(fā)明的標(biāo)記物更加準(zhǔn)確。本發(fā)明 的上述生物標(biāo)記物組合的發(fā)現(xiàn)和提出基于本身生物標(biāo)記物是反映疾病存在和狀態(tài)的一種 可測(cè)量的指示物，在疾病、應(yīng)激和康復(fù)的過程中，任何的生理變化最終都能在蛋白水平上得 到體現(xiàn)，是疾病研究最直觀的手段；并且多個(gè)蛋白生物標(biāo)志物組群與慢性病患者的臨床及 預(yù)后密切相關(guān)，表明同步聯(lián)合測(cè)定多個(gè)蛋白因子有助于更全面的了解疾病進(jìn)程。
[0019] 上述提出的生物標(biāo)記物組合中的蛋白，屬于疾病所特有的調(diào)節(jié)性蛋白。由于組織 液，如血漿中蛋白種類過千，濃度范圍跨度高達(dá)10 1°,用最先進(jìn)性的儀器也只能測(cè)到濃度范 圍跨度1〇3;為攻克健康背景蛋白對(duì)疾病特有的調(diào)劑蛋白的干擾。在本發(fā)明采用差異分析的 方法篩選到以上標(biāo)志蛋白，并進(jìn)行了驗(yàn)證。具體篩選過程如下：
[0020] (1)選取已知身體狀況的受試者共210例，其中健康對(duì)照55例，胰腺癌初期患者 (未轉(zhuǎn)移）65例，發(fā)生轉(zhuǎn)移胰腺癌患者90例。（本研究已被倫理審核機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，所有受試者 均簽署知情同意書。）
[0021] 分別取受試者血液樣本2ml，加入1%肝素，于4度，3500RPM離心15min后將血漿 分裝分別根據(jù)患病與否分為健康對(duì)照血漿樣本、胰腺癌初期（未轉(zhuǎn)移）患者血漿樣本和發(fā) 生轉(zhuǎn)移胰腺癌患者血漿樣本；
[0022] (2)然后用健康對(duì)照血漿樣本作為抗原免疫家兔，制備多克隆抗體；并用該制備 的多克隆抗體作為親和介質(zhì)制備親和層析柱；
[0023] (3)將胰腺癌初期患者樣本，發(fā)生轉(zhuǎn)移胰腺癌患者樣本分別用上述親和層析柱上 樣過柱子，收集流穿液。
[0024] 由于體液如血漿中蛋白種類過千，濃度范圍跨度高達(dá)10'目前最先進(jìn)性的儀器也 只能測(cè)到濃度范圍跨度1〇 3;目前用抗體親和去除樣品中20到100多個(gè)高豐度蛋白，盡管提 高了對(duì)低豐度蛋白的檢出率，當(dāng)相對(duì)于血漿中1000多個(gè)蛋白來說，殘留的相對(duì)高豐度蛋白 對(duì)目前癌癥所用標(biāo)志物的ng濃度和癌癥發(fā)生發(fā)展孕育期相關(guān)標(biāo)志物的pg濃度的分析信號(hào) 仍然存在嚴(yán)重的淹沒效果?；谝陨显?，本發(fā)明采用差減法技術(shù)，用健康對(duì)照的血漿樣本 作為抗原免疫家兔，制備抗健康對(duì)照血漿蛋白的多克隆抗體，采用這一抗體作為親和吸附 介質(zhì)制備層析柱，便能將患者血漿樣本中的大量健康相關(guān)蛋白特異性吸附去除，從而盡可 能多地獲得疾病相關(guān)，排除健康相關(guān)高豐度蛋白的干擾。
[0025] 低豐度差異表達(dá)蛋白在富集之后，由于去除了大量的高豐度蛋白的背景干擾，而 且在量進(jìn)行了富集之后，便能用SDS-PAGE和質(zhì)譜的手段分析和檢測(cè)出來了。
[0026] (4)將上述收集到的流穿液用質(zhì)譜技術(shù)鑒定及定量蛋白
[0027] 前期篩選階段，健康對(duì)照組、胰腺癌初期患者（未轉(zhuǎn)移）、發(fā)生轉(zhuǎn)移胰腺癌患者分 別進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，重復(fù)三次，每組蛋白三次重復(fù)中共同鑒定到的蛋白分別鑒定到210、320 和378個(gè)蛋白。
[0028] 因本發(fā)明旨在尋找胰腺癌早期生物標(biāo)志物，其中僅在胰腺癌初期患者（未轉(zhuǎn)移）、 發(fā)生轉(zhuǎn)移胰腺癌患者中均出現(xiàn)，但在健康對(duì)照中未出現(xiàn)的蛋白有45個(gè)。在健康對(duì)照組、胰 腺癌初期患者（未轉(zhuǎn)移）、發(fā)生轉(zhuǎn)移胰腺癌患者均出現(xiàn)的蛋白有179個(gè)。本試驗(yàn)主要針對(duì)僅 在胰腺癌初期患者（未轉(zhuǎn)移）、發(fā)生轉(zhuǎn)移胰腺癌患者中共同出現(xiàn)的45個(gè)蛋白進(jìn)行分析。
[0029] 通過文獻(xiàn)報(bào)道和生物信息學(xué)分析（Gene Ontology和KEGG Pathway分析）對(duì)在建 康對(duì)照中未出現(xiàn)，但在胰腺癌患者血漿中出現(xiàn)的45種進(jìn)行分析，功能注釋。發(fā)現(xiàn)CRP (C反 應(yīng)蛋白），ICAM-I (細(xì)胞間黏附分子-I)、OPG (骨保護(hù)素）、CA19-9在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程 中發(fā)揮著非常重要的作用。
[0030] (5) ELISA 法驗(yàn)證
[0031] 利用ELISA確認(rèn)上述差異蛋白在正常對(duì)照和各疾病組血液中的表達(dá)量。具體地 說，利用稀釋緩沖液將血漿1 :1〇〇稀釋，然后利用針對(duì)不同蛋白生物標(biāo)志物的ELISA板測(cè)量 不同疾病組血液中生物標(biāo)志物的含量，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量三次。ELISA技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果數(shù) 據(jù)用SPSS 14.0軟件處理，以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。用ANOVA進(jìn)行正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比 較；用受試者工作特性曲線（ROC)分析各種生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性、特異性及靈敏性。檢 測(cè)的結(jié)果如下表1，從表1的結(jié)果顯示，胰腺癌組血漿中CRP (C反應(yīng)蛋白）、ICAM-I (細(xì)胞間 黏附分子-I)、OPG (骨保護(hù)素）、CA19-9的表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照，且隨著患者病情的嚴(yán) 重（蛋白尿增加）而增加。
[0032] 表1. ELISA驗(yàn)證4種胰腺癌早期標(biāo)志物
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[0034] 注：ND:No Difference ;*ρ〈0· OOlvs.健康對(duì)照；
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