0035] 進(jìn)一步利用受試者工作特性曲線（ROC)分析胰腺癌患者和健康對照血液中的四 種生物標(biāo)志物，結(jié)果表明CRP(C反應(yīng)蛋白），ICAM-I (細(xì)胞間黏附分子-I)、0PG(骨保護(hù) 素）、CA19-9 曲線下面積（AUC)分別為 0· 892 (ρ〈0· 01)、0· 858 (ρ〈0· 01)、0· 907 (ρ〈0· 01)和 0. 901 (ρ〈0. 01)。敏感性和特異性分析顯示，當(dāng)選取最高"youden"指數(shù)時(shí)，血液中四種生物 標(biāo)志物的靈敏度、特異度和濃度截?cái)嘀档慕Y(jié)果見下表2,從表2結(jié)果表明這4種蛋白分子可 能參與了胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程，為可信的胰腺癌早期生物標(biāo)記物。
[0036] 表2 :胰腺癌患者和健康對照中各生物標(biāo)記物的ROC分析對比結(jié)果
[0037]
[0038] (6)以上述四種蛋白標(biāo)記物對另100名胰腺癌早期檢查驗(yàn)證
[0039] 對另100名胰腺癌早期患者，通過健康對照的測定結(jié)果及四種蛋白分子濃度截?cái)?值來確定這4種蛋白標(biāo)志物相對含量參考正常范圍，結(jié)合四種生物標(biāo)志物測量結(jié)果來判 斷。對各種組合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，比較不同組合的靈敏度和特異度，其結(jié)果參見下表3。其中， 表3中符號" η "表示的組合中，該組合所含的所有生物標(biāo)志物均為陽性（即高于截?cái)嘀担?時(shí)，計(jì)算靈敏度和特異度。在符號" U "表示的組合中，該組合所含的生物標(biāo)志物有一個(gè)為 陽性時(shí)即判斷為陽性，計(jì)算靈敏度和特異度。
[0040] 表3用于診斷早期胰腺癌蛋白生物標(biāo)志物組合靈敏度和特異性：
[0041]
[0043] ~根據(jù)上表2的組合1檢測的結(jié)果表明，這表示fi據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇生物標(biāo)^ 物的組合，能高效、特異的用于疾病診斷；而且還可以進(jìn)一步確定，靈敏度高的組合 (CA19-9 U OPG ；CA19-9 U CRP ；CA19-9 U ICAM-I ；ICAM-I U OPG ；ICAM-I U CRP U OPG ； ICAM-I U CRP U OPG U CA19-9)適合于初次篩查；相反，特異度高的組合 (CA19-9 Π OPG ；CA19-9 n CRP ；CA19-9 n ICAM-I ；ICAM-I n OPG ；ICAM-I Π CRP Π OPG ； ICAM-I η CRP η OPG η CA19-9)適合二次檢查或三次檢查等需要進(jìn)行可靠性更高的判斷檢 查。例如，若在初次篩查時(shí)出現(xiàn)陽性，此時(shí)通過特異度較高的組合方法對初次檢查結(jié)果進(jìn)行 二次判定，最終給出有效且可靠的早期胰腺癌診斷參考結(jié)果。
[0044] 因此基于上述生物標(biāo)記物的提出，本發(fā)明提出上述4種生物標(biāo)記蛋白應(yīng)用于胰腺 癌的檢測裝置。檢測裝置以上述確定的4種生物標(biāo)記蛋白作為基礎(chǔ)，進(jìn)行相應(yīng)的生化檢測， 其應(yīng)用中相比現(xiàn)有的其他的檢測的方式和手段上，相比現(xiàn)有的檢測標(biāo)記物具有更高的特異 性和靈敏性。
[0045] 本發(fā)明在上述胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物組合的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提出胰腺癌蛋白生 物標(biāo)記物的檢測芯片，檢測芯片包括：固相載體，以及固定在該固相載體上的CRP單抗， ICAM-I單抗、OPG單抗和CA 19-9單抗。
[0046] 本發(fā)明的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片，通過在固相載體上固定上述蛋白質(zhì) 生物標(biāo)記物的單克隆抗體，通過對應(yīng)的單抗捕獲能與之特異性結(jié)合的待測蛋白，從而實(shí)現(xiàn) 對存在于血清、血漿、淋巴、間質(zhì)液、尿液、滲出液、細(xì)胞溶解液、分泌液等待測樣品中的目的 標(biāo)記蛋白進(jìn)行分離；之后再經(jīng)洗滌、純化、確認(rèn)和生化分析；即可得到待測樣品中的這些生 物標(biāo)記蛋白的差異表達(dá)結(jié)果。
[0047] 其中，上述胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片中所包含的4種生物標(biāo)記蛋白的單 抗，在本發(fā)明中采用家兔作為免疫體進(jìn)行免疫制備單克隆抗體，比如以CRP單抗的制備為 例，具體包括：
[0048] (1)選用4個(gè)月左右的雌性小白鼠進(jìn)行CRP蛋白的免疫注射，注射后該CRP蛋白作 為抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入家兔外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其 活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞；
[0049] (2)在免疫達(dá)到目標(biāo)程度時(shí)處死家兔，取家兔脾臟；細(xì)碎之后酶消化法消化成單 細(xì)胞懸液，并用腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合雜交；
[0050] (3)細(xì)胞融合之后用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，篩選成功融合的雜交細(xì) 胞；
[0051] (4)再將成功融合的細(xì)胞有限稀釋法進(jìn)行雜交細(xì)胞的克隆培養(yǎng)；培養(yǎng)之后采用免 疫方法，篩選出能產(chǎn)生CRP蛋白單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞；并將該陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn) 行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中適時(shí)誘導(dǎo)其表達(dá)，結(jié)束后分離培養(yǎng)液即可得到CRP單抗。
[0052] 分別制備得到上述CRP單抗，ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9單抗之后，然后采用 共價(jià)交聯(lián)或者非共價(jià)交聯(lián)的方式將其固定至固相載體上即可。
[0053] 在實(shí)施中作為蛋白質(zhì)芯片的固相載體一般可以從硝酸纖維素膜、尼龍膜、金膜、平 板或者玻璃基片中進(jìn)行選用。在本發(fā)明中基于上述單抗所要進(jìn)行低豐度差異蛋白特異性吸 附的目的，優(yōu)選采用硝酸纖維素膜或玻璃基片。其原因在于，硝酸纖維素膜自身是滲透濾 膜，而且經(jīng)過硝基化的纖維素微孔薄膜，為空結(jié)構(gòu)的容量較大，而且對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的結(jié)合 力。
[0054] 而其中采用玻璃基片主要是方便、廉價(jià)、處理簡便，而且具有足夠的穩(wěn)定性和惰 性，能非常適于本發(fā)明產(chǎn)品的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。但是，在使用中需要針對本發(fā)明的特點(diǎn) 對該玻璃基片進(jìn)行處理，因?yàn)樽鳛榈鞍纵d體的玻璃基片是玻璃片多采用表面羥基先用N， N-二乙氧基氨丙基三乙氧基硅烷做表面處理；然后偶聯(lián)抗體蛋白，但是玻璃基片有非常強(qiáng) 的非特異性吸附，容易造成很嚴(yán)重的背景干擾，尤其是在本發(fā)明中所要檢測的上述4種目 的蛋白都是低豐度蛋白時(shí)，大量的高豐度蛋白的干擾程度會更為強(qiáng)烈。所以本發(fā)明采用玻 璃基片作為固相載體使用時(shí)，用PEG(聚乙二醇）對玻璃基片進(jìn)行表面處理，用PEG處理的 表面比硅化表面信號強(qiáng)度更好，能提高大分子分析元件（如配體）與其結(jié)合的能力，并可以 減弱非特異性結(jié)合；這是因?yàn)镻EG的空間結(jié)構(gòu)大，從而降低了蛋白質(zhì)之間的空間位阻，可以 提升親和吸附的特異性。
[0055] 為了便于本發(fā)明上述蛋白芯片檢測的對比，本發(fā)明的上述蛋白芯片上還固定有陽 性對照和陰性對照。其中，陽性對照可以采用IgG單克隆抗體，這個(gè)陽性對照的IgG單克隆 抗體最好采用上述相同免疫機(jī)體制備，比如上述CRP單抗采用家兔為免疫體制備，那么該 IgG單克隆抗體也最好對應(yīng)以家兔為免疫體制備；采用該陽性對照，檢測目的蛋白的結(jié)合 情況。當(dāng)然，對應(yīng)上述陽性對照，陰性對照可以采用樣品上樣的點(diǎn)樣稀釋液，其不含有任何 可結(jié)合的蛋白，正好作為空白對照。
[0056] 為了方便結(jié)果對比并防止交叉污染等情況，本發(fā)明的上述蛋白芯片的固相載體上 設(shè)置點(diǎn)樣孔，且這些點(diǎn)樣孔可以按照矩陣式或者陣列式的方式設(shè)置于固相載體的表面上， 然后將對應(yīng)用于檢測生物標(biāo)記蛋白的單抗固定在這些點(diǎn)樣孔中。采用該點(diǎn)樣孔的結(jié)構(gòu)進(jìn)行 操作檢測，一方面點(diǎn)樣孔中的蛋白質(zhì)可以很好地分離，而使交叉污染降到最小；另一方面， 孔的凹陷結(jié)構(gòu)可以利于添加和保存點(diǎn)樣緩沖液等等，避免點(diǎn)樣之后的樣品在孵育時(shí)出現(xiàn)干 化等問題；第三，可以對點(diǎn)樣孔的規(guī)則和尺寸進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)定，從而利于對點(diǎn)樣的量進(jìn)行橫 向比對，即可精確控制點(diǎn)樣量，還更加利于橫向?qū)Ρ燃敖Y(jié)果的計(jì)算。
[0057] 出于與上述胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片更加便捷的進(jìn)行情況，本發(fā)明還提 出一種胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測試劑盒；試劑盒中包括用于特異性檢測上述胰腺癌蛋 白生物標(biāo)記物的CRP單抗，ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9單抗。用與上述蛋白生物標(biāo)記 物對應(yīng)的單克隆抗體制備試劑盒，進(jìn)行特異性的檢測。用該試劑盒檢測可以多種方法實(shí)現(xiàn)， 比如將上述4種單抗分別作為層析介質(zhì)制成層析柱，然后對待測樣品進(jìn)行過柱，之后再輔 助電泳、質(zhì)譜等手段進(jìn)行檢測?；蛘咭部梢圆捎妹笜?biāo)抗原的方式進(jìn)行，將待測的樣品蛋白進(jìn) 行酶標(biāo)之后與上述4種單抗分別進(jìn)行親和反應(yīng)，反應(yīng)之后對各自單抗結(jié)合的酶標(biāo)抗原進(jìn)行 信號檢測。
[0058] 但是上述兩種檢測的方法均不方便，因?yàn)榱烁M(jìn)一步提升檢測的便利性和準(zhǔn)確 性，本發(fā)明的上述試劑盒參考雙抗夾心法輔助搭配輔助試劑，進(jìn)一步，輔助試劑包括樣品稀 釋緩沖液，本發(fā)明中采用含有1. 5%~2% BSA(牛血清白蛋白）穩(wěn)定劑的30~70mM的PBS 磷酸鹽緩沖液作為該樣品稀釋緩沖液；采用該樣品稀釋緩沖液進(jìn)行樣品稀釋和洗滌，其中 BSA是蛋白的穩(wěn)定劑，防止蛋白的分解和非特異性吸附；且BSA還能減輕有些不利環(huán)境因素 如加熱，表面張力及化學(xué)因素，從而減輕檢測過程中有些蛋白的變性。
[0059] 為了提升試劑盒試劑檢測中的結(jié)果檢測和靈敏性分析，本發(fā)明的上述試劑盒進(jìn)一 步按照雙抗夾心法的原理還