需輔助搭配酶標(biāo)二抗；在對待測樣品點樣之后，各目的蛋白會 被對應(yīng)的單抗捕獲而親和吸附結(jié)合，此時再添加過量酶標(biāo)二抗用于與目的蛋白結(jié)合，生成 夾心體結(jié)構(gòu)；那么結(jié)合上的酶標(biāo)二抗的量就能反應(yīng)待測樣品中目的蛋白的表達情況，通過 計算酶標(biāo)二抗所攜帶的信號就可得到目的蛋白的結(jié)果數(shù)據(jù)。其中在本發(fā)明實施中，上述酶 標(biāo)二抗可以采用比較通用的含HRP (辣根過氧化物酶）的酶標(biāo)二抗進行，在滿足準(zhǔn)確性的情 形下，也省去了自行設(shè)計制造的麻煩。
[0060] 同時，為了便于對之后酶標(biāo)二抗信號的檢測，在試劑盒中進一步還可以包含有濃 縮洗滌液含有1~2% BSA、0. 03~0. 07%吐溫-20的PBS，用于濃縮酶標(biāo)二抗和信號檢測 的顯色成分。當(dāng)然，對應(yīng)需要在之后添加顯色劑，TMB (四甲基聯(lián)苯胺）底物液。
[0061] 當(dāng)然，為了便于雙夾心法進行檢測，在試劑盒中還可以提供固相基質(zhì)，該固相基質(zhì) 在實施中是類似于上述芯片的基質(zhì)，充當(dāng)載體和反應(yīng)介質(zhì)的功能。具體的形狀和形態(tài)也可 以參見上述芯片中的描述，在使用的過程中，根據(jù)試劑盒說明書的指示將對應(yīng)的單抗固定 至固相基質(zhì)的點樣孔中，然后進行待測樣品的檢測；當(dāng)然如果本發(fā)明試劑盒中不提供該固 相基質(zhì)載體，實施中也可以借用ELISA試劑盒的點樣板進行。
[0062] 同時，為了便于結(jié)果的對比分析，試劑盒中可以提供標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照和陰性對 照。對照的設(shè)置可以參見上述芯片中的描述，而其用法與待測樣樣品相同，使用時與待測樣 品同步進行操作，之后將結(jié)果進行比對，提供對比參照。
[0063] 基于上述檢測芯片，本發(fā)明還提出一種包括有上述檢測芯片的胰腺癌檢測裝置設(shè) 備。具體實施中可以將上述芯片和檢測芯片信號的設(shè)備如CCD檢測儀等同類似的這些檢測 信號設(shè)備進行組合；或者是將芯片直接固定置于檢測的檢測口中，制成一個整體。
[0064] 本發(fā)明的這一包括檢測芯片的檢測裝置設(shè)備，將檢測芯片制成直接能完整檢測上 述生物標(biāo)記蛋白的整體設(shè)備，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合從而對上述生物標(biāo)記蛋白進行 檢測，具有比較高的準(zhǔn)確性和特異性。
[0065] 為說明本發(fā)明所采用的生物標(biāo)記物的準(zhǔn)確性和應(yīng)用試劑盒進行檢測結(jié)果的真實 性，以及使上述實施的技術(shù)細節(jié)和過程方法能更易于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解和實施參考， 以下通過具體的實施例和實際分析數(shù)據(jù)進行舉例說明。
[0066] 實施例1
[0067] 實施例1用于說明采用本發(fā)明的上述生物標(biāo)記物進行胰腺癌檢測的準(zhǔn)確性和應(yīng) 用試劑盒進行檢測結(jié)果的真實性。
[0068] S11，制備固相基質(zhì)載體（以硝酸纖維素膜為例進行）：
[0069] 獲取基質(zhì)硝酸纖維素膜，并按照設(shè)計的（點陣形式為5*5陣列，如圖1所示，圖1 中標(biāo)示1為定位點、2為陽性對照點樣孔、7為陰性對照點樣孔、3為CRP點樣孔、4為ICAM-I 點樣孔、5為OPG點樣孔、6為CA19-9點樣孔）的排列方式和點樣位置在膜上制備具有檢測 指標(biāo)涂層的點樣孔，封閉；最后干燥，封裝后于4°C保存，之后的形狀如圖2所示；
[0070] S12,在固相基質(zhì)上固定CRP單抗、ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9單抗，其中以 CRP單抗為例進行說明（其中CRP單抗的制備參見上述實施例中的家兔免疫的制備過程，在 此不再贅述；剩余ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9單抗的固定方式參照該過程進行）：
[0071] 首先將0. 01~0. 5mg/mL的CRP單抗于50mM pH7. 2的PBS緩沖液中，制備用于固 定的單抗溶液；
[0072] 用戊二醛活化硝酸纖維素膜載片上的點樣孔后，用100 μ 1先前制備的單抗溶液 在點樣孔上進行點樣，然后蓋上蓋片，孵育固定5h左右。然后，孵育完成之后用50mM ρΗ7. 2 的PBS緩沖液洗滌三到四次，去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)后晾干備用；
[0073] 為了將戊二醛活化點樣孔中要固定CRP單抗的那部分（不與目的蛋白CRP在表面 上反應(yīng)的那部分）封閉，在點樣孔上在滴加含有2% BSA的50mM的pH7. 2PBS緩沖液溶液； 然后蓋上蓋片孵育2h ;用BSA封閉過的載片前后表面用50mM的pH7. 2PBS緩沖液溶液洗滌 三到四次，晾干備用。
[0074] S13,獲取待檢測的尿液樣品，然后與陰性對照和陽性對照用樣品稀釋液（含有 1. 5%~2% BSA穩(wěn)定劑的30~70mM的PBS緩沖液）稀釋3倍后，分別加入檢測的點樣孔 中，每個反應(yīng)孔加樣0. lmL，每個樣品做3次平行試驗，置37°C孵育1小時使充分反應(yīng)，后棄 去孔內(nèi)溶液，用濃縮洗滌液洗滌3次；
[0075] S14,每孔加入酶標(biāo)工作液（含HRP的酶標(biāo)二抗）100ul，37°C孵育30分鐘，震蕩洗 滌3次，每次1分鐘；
[0076] S15,將與酶標(biāo)工作液配套的顯色劑TMB (四甲基聯(lián)苯胺）底物液加入芯片反應(yīng)區(qū) 域上，每孔加20ul，進行化學(xué)發(fā)光。
[0077] S16,用CCD檢測儀進行化學(xué)發(fā)光的掃描并收集信號，依據(jù)掃描結(jié)果顯示分析檢測 結(jié)果，確定這些生物標(biāo)記蛋白的表達量是否正常。
[0078] 采用上述實施的過程，對500名受試者（年齡層次58~70)的上述生物標(biāo)記蛋白 進行檢測，檢測結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其中有24名受試者根據(jù)上表3的組合類別的方式進行二次 判定為疑似胰腺癌患者；在后續(xù)的半年內(nèi)對這24非正常的受試者進一步進行跟蹤和再次 臨床檢驗和綜合癥狀分析。結(jié)果表明，24人中有22人被確診為胰腺癌患者（其中，6人屬 于已經(jīng)擴散的類型，其中有16人屬于初期未擴散的類型），剩余2人認(rèn)定不屬于胰腺癌患 者，而是其他干擾病癥。
[0079] 從最終的統(tǒng)計結(jié)果看，本發(fā)明針對上述標(biāo)記物的檢測試劑盒，其以雙抗夾心法為 基礎(chǔ)，對應(yīng)構(gòu)建檢測上述生物標(biāo)記物的親和抗體進行檢測，具有比較高的準(zhǔn)確性和敏感性。 而且相比目前CA19-9、CEA、CA242胰腺癌檢測標(biāo)記物，能涵蓋胰腺癌發(fā)病早期的狀況而不 至于錯過治療。
[0080] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物，其特征在于，包括在人體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可 檢測的 CRP、ICAM-I、OPG 和 CA 19-9。2. 如權(quán)利要求1所述的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物在胰腺癌檢測裝置中的應(yīng)用。3. -種權(quán)利要求1所述的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片，其特征在于，包括固相 基質(zhì)，以及固定于該固相基質(zhì)上的CRP單抗、ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9單抗。4. 如權(quán)利要求3所述的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片，其特征在于，所述固相基 質(zhì)為硝酸纖維素膜、尼龍膜、金膜、平板或者玻璃基片中的一種。5. 如權(quán)利要求4所述的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片，其特征在于，所述玻璃基 片為用PEG進行表面處理后的玻璃基片。6. 如權(quán)利要求3至5任一項所述的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片，其特征在于， 所述固相基質(zhì)上設(shè)置有矩陣排列的點樣孔，所述CRP單抗、ICAM-I單抗、OPG單抗和CA19-9 單抗分別固定于所述點樣孔內(nèi)。7. 如權(quán)利要求3至5任一項所述的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片，其特征在于，所 述固相基質(zhì)上還設(shè)置有陽性對照和/或陰性對照。8. -種包括有權(quán)利要求3至7任一項所述的胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片的胰腺 癌檢測裝置。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物及其應(yīng)用，其中標(biāo)記物包括在人體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的CRP、ICAM-1、OPG和CA19-9。本發(fā)明的上述胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物通過低豐度差異研究的方式篩選得到，驗證表明其參與了胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程，為可信的胰腺癌早期生物標(biāo)記物，相比現(xiàn)有的檢測標(biāo)記物具有更高的特異性和靈敏性。在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步還提出針對胰腺癌蛋白生物標(biāo)記物的檢測芯片和包括該檢測芯片的檢測設(shè)備，檢測芯片以用CRP、ICAM-1、OPG和CA19-9進行免疫制備的特異性CRP單抗、ICAM-1單抗、OPG單抗和CA19-9單抗為基礎(chǔ)，固定在固相基質(zhì)上形成芯片，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合從而對上述生物標(biāo)記蛋白進行檢測，具有比較高的準(zhǔn)確性和特異性。
【IPC分類】G01N33/574
【公開號】CN105092845
【申請?zhí)枴緾N201510408299
【發(fā)明人】張貫京, 李榮秀, 鄧立, 肖華, 克里斯基捏·普拉紐克, 艾琳娜·古列莎, 波達別特·伊萬, 張舒林
【申請人】深圳市貝沃德克生物技術(shù)研究院有限公司, 深圳市華科安測信息技術(shù)有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年7月10日