液。
[0078] (4)勻漿器勻漿（15000轉(zhuǎn)/min)，直至充分裂解。
[0079] (5)充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)Bio-plex懸 液芯片系統(tǒng)細胞因子測定。
[0080] 2. Bio-plex懸液芯片系統(tǒng)測定細胞因子。
[0081] 1)材料：
[0082] Bio-plex Protm Human Cytokine Grp I Panel 27-Plex,
[0083] Cat. #5〇_OKCAFOY 購自 Bio-Rad 公司。
[0084] 2)方法：
[0085] 1.以lOOuLBio-Plex Assay Buffer潤濕96孔板，再用真空吸板機吸去所有 buffer ；
[0086] 2.每孔加入 50uL磁珠，真空吸去buffer ;用 100uLBi〇-Plex wash buffer洗 2 次， 分別真空吸去buffer ;
[0087] 3.輕彈樣品和標準管3-5次，每孔加入50uL，用鋁薄蓋住，先1100轉(zhuǎn)室溫搖床30 秒，再以300轉(zhuǎn)搖30min ;
[0088] 4.然后輕輕移去錯薄，避免滅出，真空抽去buffer,再100uLBi〇-Plex wash buffer洗3次，分別真空吸去buffer ;
[0089] 5.檢測抗體加入前漩渦混合，每孔加入25uL，蓋上鋁薄，先1100轉(zhuǎn)室溫搖床30 秒，再以300轉(zhuǎn)搖30min ;
[0090] 6.然后輕輕移去錯薄，避免滅出，真空抽去buffer,再以100uLBi〇-Plex wash buffer洗3次，分別真空吸去buffer ;
[0091] 7. Streptavidin-PE突光色素加入前漩渦混合，每孔加入50uL，用錯薄蓋住，先 1100轉(zhuǎn)室溫搖床30秒，再以300轉(zhuǎn)搖10min ;
[0092] 8.然后輕輕移去錯薄，避免滅出，真空抽去buffer,再100uLBi〇-Plex wash buffer洗3次，分別真空吸去buffer ;
[0093] 用125uL Bio-Plex assay buffer重懸微珠，以密封袋蓋住，1100轉(zhuǎn)室溫搖床30 秒，便可放入儀器中進行讀盤檢測。
[0094] 實施例1非小細胞肺癌病例收集
[0095]自東方醫(yī)院收集了 22例非小細胞肺癌病例，其中包括了病理結(jié)果經(jīng)確認的鱗癌、 腺癌、低分化癌（包括非小細胞型癌）類型。
[0096] 此外，還提供了按淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移進行分離的22個轉(zhuǎn)移病理數(shù)據(jù)。
[0097] 實施例2非小細胞肺癌中細胞因子的測定
[0098] 2. 1采用通用方法，對這些病例中的IL-12的表達量進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在非 小細胞肺癌中，IL-12的表達顯著高于癌旁組織（T/N比值遠大于1. 5, P < 0. 05)。
[0099] 此外，出乎意料是的，鱗癌的T/N比值（平均值）為2. 4,顯著高于腺癌的T/N比值 1.9。這表明，與腺癌相比，IL-12在非小細胞肺癌的鱗癌中表達差異性更顯著。
[0100] 更出乎意料的是，通過數(shù)據(jù)的分析，T/N比值在無淋巴或遠處轉(zhuǎn)移的病例中保持相 對較低水平，而在有遠處轉(zhuǎn)移的病例中，T/N比值顯著高于癌旁組織。按轉(zhuǎn)移程度分的T/N 比值結(jié)果見表1 :
[0101] 表 1
[0102]
[0103] 2. 2非小細胞癌中IL-8和IL-lb的測定
[0104] 采用相同方法，對IL-lb和IL-8的表達量也進行了測定，結(jié)果表明，IL-lb和IL-8 在非小細胞肺癌中也有非常顯著的高表達。其中，IL-8的T/N平均值為5. 1，IL-lb的T/N 平均值為8. 2。
[0105] 實施例3擴大樣本量的驗證
[0106] 采用相同方法，根據(jù)以上的預(yù)實驗結(jié)果，擴大樣本量至各60例，分別測定發(fā)生遠 處轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌中，IL-12的表達量。
[0107] 結(jié)果表明，在發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌中，IL-12的表達量（T/N平均值約 2. 2)顯著高于未轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌（T/N平均值約0. 8)。
[0108] 實施例4過表達IL-12對非小細胞癌細胞系侵襲性的影響
[0109] 先將人白血病單核細胞系THP-1，經(jīng)過佛波酯刺激后分化成為巨噬細胞，檢測細 胞因子IL-lb、Il-8和IL-12的表達量；然后將非小細胞肺癌細胞系于六孔板小室中與巨噬 細胞共培養(yǎng)，觀察其生物學形態(tài)改變；應(yīng)用Transwell侵襲小室檢測共培養(yǎng)體系中非小細 胞肺癌細胞侵襲能力的改變。
[0110] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-12能夠使非小細胞肺癌細胞系的侵襲性顯著增加。
[0111] 實施例5抑制IL-12對非小細胞肺癌細胞系侵襲性的影響
[0112] 先將人白血病單核細胞系THP-1，經(jīng)過佛波酯刺激后分化成為巨噬細胞，檢測 細胞因子IL-1、11-8和IL-12的表達量；然后將非小細胞肺癌細胞系于六孔板小室中與 巨噬細胞共培養(yǎng)，同時加入IL-1、11-8和IL-12的抗體，觀察其生物學形態(tài)改變；應(yīng)用 Transwell侵襲小室檢測共培養(yǎng)體系中非小細胞肺癌細胞侵襲能力的改變。
[0113] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制IL-12能夠使非小細胞肺癌細胞系侵襲性得到抑制。
[0114] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 白介素-12 (IL-12)或其檢測試劑的用途，其特征在于，用于制備預(yù)測或診斷非小細 胞肺癌遠處轉(zhuǎn)移的試劑盒。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的非小細胞肺癌包括肺鱗癌、肺腺癌、 低分化肺癌、大細胞肺癌；較佳地，為肺鱗癌。3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑盒還含有白介素_8 (IL-8)、和/ 或白介素-l(IL-l)的檢測試劑。4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的遠處轉(zhuǎn)移包括除肺部以外的其他器 官的轉(zhuǎn)移。5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述IL-12的檢測試劑為IL-12的抗體。6. -種用于預(yù)測或診斷非小細胞肺癌遠處轉(zhuǎn)移的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒 含有一容器，所述的容器中含有IL-12的檢測試劑；以及標簽或說明書。7. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的標簽或說明書中注明以下內(nèi)容： 當檢測樣本中的IL-12表達量C1與對照樣本中IL-12表達量C0相比，C1彡1. 3C0,較 佳地C1彡1.5C0,更佳地，C1彡2. 0C0,則表明該檢測樣本為有遠處轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌概 率大，或表面該非小細胞肺癌樣本可能發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。8. -種IL-12抑制劑的用途，其特征在于，用于制備抑制非小細胞肺癌遠處轉(zhuǎn)移和/或 抑制非小細胞肺癌細胞侵襲或遷移的藥物組合物。9. 一種非診斷性的預(yù)測或判斷非小細胞肺癌細胞株是否為高侵襲性細胞株的方法，其 特征在于，包括步驟：測定所述的非小細胞肺癌細胞株中IL-12的表達量，當IL-12的表達 量顯著高于正常肺細胞內(nèi)IL-12的表達量，則說明所述非小細胞肺癌細胞株為高侵襲性細 胞株。10. -種體外非治療性的抑制非小細胞肺癌細胞侵襲或遷移的方法，其特征在于，包括 步驟： 在IL-12抑制劑存在的條件下，培養(yǎng)非小細胞肺癌細胞，從而抑制非小細胞肺癌侵襲 或遷移。
【專利摘要】本發(fā)明公開了IL-12在診斷和治療非小細胞肺癌遠處轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明公開了IL-12用于制備預(yù)測或診斷非小細胞肺癌遠處轉(zhuǎn)移的試劑盒。實驗證明炎癥細胞因子IL-12參與了非小細胞肺癌(鱗癌)遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展，而抑制IL-12則對非小細胞肺癌的侵襲性具有抑制作用。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號】CN105572380
【申請?zhí)枴緾N201410624289
【發(fā)明人】徐增光, 劉亞麗, 曹月譽, 袁健, 李兵, 馬鉆, 鄧生瓊, 魏夢丹
【申請人】上海市東方醫(yī)院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年11月6日