利用單個(gè)發(fā)光粒子檢測(cè)的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序的制作方法
【專利說(shuō)明】利用單個(gè)發(fā)光粒子檢測(cè)的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種光分析技術(shù)，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，檢測(cè)來(lái)自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的對(duì)象物、或非生物學(xué)粒子的光，來(lái)獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時(shí)有用的信息，更詳細(xì)地說(shuō)，涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自單個(gè)發(fā)光的粒子的光并進(jìn)行各種光分析的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序。此外，在本說(shuō)明書(shū)中，發(fā)光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)可以是其自身發(fā)光的粒子、或附加了任意的發(fā)光標(biāo)識(shí)或發(fā)光探針的粒子，從發(fā)光粒子發(fā)出的光可以是熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、散射光等。
【背景技術(shù)】
[0002]由于近年來(lái)的光測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)/測(cè)定單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的測(cè)量技術(shù)對(duì)生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結(jié)合/離解反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的光分析技術(shù)。作為這樣的光分析技術(shù)，例如已知有焚光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlat1n Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻(xiàn)1_
3)、焚光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribut1n Analysis:FIDA。例如專利文獻(xiàn)4)、光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻(xiàn)5)等。另外，在專利文獻(xiàn)6?8中，提出了根據(jù)利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)量出的樣本溶液的熒光信號(hào)的時(shí)間經(jīng)過(guò)來(lái)檢測(cè)熒光性物質(zhì)的方法。
[0003]并且，本申請(qǐng)的申請(qǐng)人在專利文獻(xiàn)9?12中提出了一種利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的光分析技術(shù)，是基于與FCS、FIDA等光分析技術(shù)不同的原理的新的光分析技術(shù)。在所述新的光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計(jì)數(shù)法”。)中，一邊使作為光的檢測(cè)區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測(cè)區(qū)±或”。在使用激勵(lì)光的情況下，與激勵(lì)光的聚光區(qū)域大致一致。)的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊利用光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)，一邊逐個(gè)檢測(cè)在光檢測(cè)區(qū)域包含在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)從該發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子逐一進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)獲取與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。
[0004]專利文獻(xiàn)I:日本特開(kāi)2005-098876
[0005]專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2008-292371
[0006]專利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2009-281831
[0007]專利文獻(xiàn)4:日本特許第4023523號(hào)
[0008]專利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開(kāi)2008-080417
[0009]專利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2007-20565
[0010]專利文獻(xiàn)7:日本特開(kāi)2008-116440
[0011 ]專利文獻(xiàn)8:日本特開(kāi)平4-337446號(hào)公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)9:國(guó)際公開(kāi)第2011/108369
[0013]專利文獻(xiàn)10:國(guó)際公開(kāi)第2011/108370
[0014]專利文獻(xiàn)11:國(guó)際公開(kāi)第2011/108371
[0015]專利文獻(xiàn)12:國(guó)際公開(kāi)第2012/099234

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0017]另外，在檢測(cè)或分析溶液中的粒子的濃度或其它狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時(shí)，粒子濃度的變化速度或粒子的相關(guān)反應(yīng)的反應(yīng)速度成為有用的信息。然而，在目前為止的掃描分子計(jì)數(shù)法中，在成為樣本溶液中的觀察對(duì)象的發(fā)光粒子的濃度隨時(shí)間變化的情況下，有時(shí)很難高精度地檢測(cè)所述發(fā)光粒子濃度或其變化速度。
[0018]如上述的文獻(xiàn)所記載的那樣，在目前為止的掃描分子計(jì)數(shù)法中，典型地，作為一個(gè)方式，在任意設(shè)定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)一邊使光檢測(cè)區(qū)域在樣本溶液中移動(dòng)一邊進(jìn)行光測(cè)量，對(duì)在所得到的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度值的數(shù)據(jù)(時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù))中檢測(cè)出的發(fā)光粒子的信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)(專利文獻(xiàn)9?11)，或者，作為其它的方式，執(zhí)行一邊使光檢測(cè)區(qū)域在樣本溶液中移動(dòng)一邊進(jìn)行的光測(cè)量以及時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)和計(jì)數(shù)，直到能夠得到任意設(shè)定的粒子的檢測(cè)數(shù)為止(專利文獻(xiàn)12)。而且，在前者的方式的情況下，基于所設(shè)定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)數(shù)來(lái)估算發(fā)光粒子的濃度，在后者的情況下，基于檢測(cè)所設(shè)定的粒子數(shù)需要的測(cè)量時(shí)間來(lái)估算發(fā)光粒子的濃度。
[0019]然而，在成為觀察對(duì)象的發(fā)光粒子的濃度未知的情況下或隨時(shí)間變化的情況下，在固定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)執(zhí)行光測(cè)量或執(zhí)行光測(cè)量直到固定檢測(cè)數(shù)為止的方式中，依賴于所設(shè)定的測(cè)量時(shí)間或信號(hào)檢測(cè)數(shù)，有時(shí)對(duì)于基于檢測(cè)結(jié)果估算出的濃度值或變化速度無(wú)法獲得充分的精度。
[0020]例如圖9所示，在固定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)進(jìn)行光測(cè)量的方式中，在所設(shè)定的測(cè)量時(shí)間比較短時(shí)(Tl)，對(duì)于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)，由于濃度變得足夠高，因此能夠檢測(cè)，但是對(duì)于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)，濃度過(guò)低而可能很難檢測(cè)。因此，如果將測(cè)量時(shí)間設(shè)定得比較長(zhǎng)(T2)，則濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)的濃度增大至可檢測(cè)的水平，但是導(dǎo)致對(duì)濃度的增加快的發(fā)光粒子在超過(guò)需要的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)執(zhí)行光測(cè)量。另外，在濃度的增加特別快的發(fā)光粒子(A、B)的情況下，由于濃度增加達(dá)到了飽和狀態(tài)，因此無(wú)法捕捉發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化。另一方面，在進(jìn)行光測(cè)量直到能夠獲得固定的檢測(cè)數(shù)為止的方式中，在所設(shè)定的檢測(cè)數(shù)比較大時(shí)(Pl)，對(duì)于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)，能夠以比較短的時(shí)間完成測(cè)量，但是對(duì)于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)，檢測(cè)需要的測(cè)量時(shí)間可能非常長(zhǎng)。因此，在減少所設(shè)定的檢測(cè)數(shù)時(shí)(P2)，對(duì)于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)，檢測(cè)需要的測(cè)量時(shí)間非常長(zhǎng)從而能夠獲得有意義的值，但是對(duì)于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)，檢測(cè)需要的測(cè)量時(shí)間過(guò)短而可能難以高精度地獲得值。另外，對(duì)于濃度的增加慢的發(fā)光粒子(D)與濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)的濃度變化速度的差異，由于檢測(cè)需要的測(cè)量時(shí)間的差為非常大的值而能夠有意義地檢測(cè)，但是對(duì)于濃度的增加快的發(fā)光粒子(A、B、C)之間的濃度變化速度，檢測(cè)需要的測(cè)量時(shí)間過(guò)短而難以高精度地檢測(cè)其差異。
[0021]S卩，在掃描分子計(jì)數(shù)法中如上述那樣在固定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)執(zhí)行光測(cè)量或執(zhí)行光測(cè)量直到固定檢測(cè)數(shù)為止的情況下，期望在某種程度上預(yù)測(cè)成為觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的濃度來(lái)預(yù)先設(shè)定適當(dāng)長(zhǎng)度的測(cè)量時(shí)間或適當(dāng)大小的信號(hào)檢測(cè)數(shù)，但是在發(fā)光粒子濃度變化的系統(tǒng)中，難以設(shè)定適當(dāng)?shù)臏y(cè)量時(shí)間或信號(hào)檢測(cè)數(shù)來(lái)進(jìn)行濃度的檢測(cè)，并且，也難以檢測(cè)濃度變化速度或反應(yīng)速度。另外，在光測(cè)量的執(zhí)行中濃度變化速度或反應(yīng)速度發(fā)生變化的發(fā)光粒子的情況下，在固定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)執(zhí)行光測(cè)量或執(zhí)行光測(cè)量直到固定檢測(cè)數(shù)為止的方式中，更難高精度地檢測(cè)發(fā)光粒子的濃度或其變化。
[0022]這樣，本發(fā)明的主要課題在于提供一種在成為觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的濃度隨時(shí)間變化的情況下也能夠進(jìn)行發(fā)光粒子濃度的估算或者濃度變化速度或反應(yīng)速度的檢測(cè)的基于掃描分子計(jì)數(shù)法的新的光分析技術(shù)。
[0023]用于解決問(wèn)題的方案
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方式，通過(guò)以下的裝置來(lái)達(dá)成上述的課題，該裝置是使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光的光分析裝置，該光分析裝置包括:光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng);光檢測(cè)部，其檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光；以及信號(hào)處理部，其生成一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊由光檢測(cè)部檢測(cè)出的來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測(cè)各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)，其中，信號(hào)處理部沿著按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的時(shí)間的經(jīng)過(guò)，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中依次測(cè)量所檢測(cè)出的發(fā)光粒子的信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔，使用依次測(cè)量出的多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔來(lái)確定表示發(fā)光粒子的濃度的指標(biāo)值。
[0025]在所述結(jié)構(gòu)中，“在樣本溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發(fā)出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子，則可以是任意的粒子。所述發(fā)光粒子典型的是熒光性粒子，但也可以是通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等來(lái)發(fā)出光的粒子。另外，特別地，在本發(fā)明中設(shè)為觀察對(duì)象的發(fā)光粒子也可以是濃度隨著時(shí)間的經(jīng)過(guò)而發(fā)生變化的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指這些顯微鏡中檢測(cè)光的微小區(qū)域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當(dāng)于該照明光會(huì)聚到的區(qū)域(在共焦顯微鏡中，特別地根據(jù)物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來(lái)確定。在發(fā)光粒子是沒(méi)有照明光而發(fā)光的情況下，例如通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光來(lái)發(fā)光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。)。另外，典型的是，光檢測(cè)部通過(guò)對(duì)每隔規(guī)定的測(cè)量單位時(shí)間(BIN ??ΜΕ)來(lái)到的光子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的光子計(jì)數(shù)，檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光，在該情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)為按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此外，在本說(shuō)明書(shū)中，在稱為“發(fā)光粒子的信號(hào)”的情況下，只要沒(méi)有特別限定，是指表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
[0026]如從上述理解的那樣，在作為本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)的掃描分子計(jì)數(shù)法中，首先，一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)，一邊依次進(jìn)行光的檢測(cè)。這樣，在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含了隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)，檢測(cè)到來(lái)自發(fā)光粒子的光，由此，檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子的存在。因而，在依次檢測(cè)出的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)，由此逐個(gè)地逐一依次檢測(cè)粒子的存在，能夠獲取與粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)有關(guān)的各種信息。在所述結(jié)構(gòu)中，關(guān)于在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中依次檢測(cè)出的發(fā)光粒子的信號(hào)，如在后面更詳細(xì)地說(shuō)明的那樣，樣本溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的在此時(shí)的濃度越高，依次產(chǎn)生的發(fā)光粒子的信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔越短。即，當(dāng)在光測(cè)量的執(zhí)行中樣本溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的濃度發(fā)生變化時(shí)，與其對(duì)應(yīng)地，發(fā)光粒子的信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔發(fā)生變化。因此，在上述的本發(fā)明中，進(jìn)一步在信號(hào)處理部中，沿著按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的時(shí)間的經(jīng)過(guò)，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中依次測(cè)量所檢測(cè)出的發(fā)光粒子的信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔，使用依次測(cè)量出的多個(gè)信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔來(lái)確定表示發(fā)光粒子的濃度的指標(biāo)