的測(cè)量時(shí)間或固定的檢測(cè)數(shù)。即，可以通過(guò)以下的處理步驟進(jìn)行發(fā)光粒子濃度值的測(cè)量:在光測(cè)量中實(shí)時(shí)地執(zhí)行信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的測(cè)量或向濃度值的換算，在參照信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔或濃度值能夠在某種程度上掌握發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為的階段結(jié)束光測(cè)量。在該情況下，在執(zhí)行光測(cè)量直到能夠在某種程度上掌握發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為為止的階段，通過(guò)參照該發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為，能夠判斷發(fā)光粒子濃度是準(zhǔn)靜態(tài)或穩(wěn)定的還是動(dòng)態(tài)的，在該時(shí)點(diǎn)，即使不等待固定的測(cè)量時(shí)間或固定數(shù)量的檢測(cè)完成而結(jié)束光測(cè)量，也能夠期待基于發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為以某種程度的精度確定發(fā)光粒子濃度值。換言之，根據(jù)參照依次測(cè)量出的信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的上述方式，即使不預(yù)先掌握發(fā)光粒子的濃度值或濃度變化速度的水平，也能夠以適當(dāng)水平的精度通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法確定發(fā)光粒子濃度。
[0074]并且，根據(jù)上述方式，能夠掌握發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為，因此也能夠估計(jì)實(shí)際沒(méi)有進(jìn)行光測(cè)量的時(shí)間中的發(fā)光粒子濃度。即，例如能夠基于所掌握的發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為(濃度變化速度等)估計(jì)任意的反應(yīng)中的反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的發(fā)光粒子濃度或者經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間之后或反應(yīng)達(dá)到飽和時(shí)的發(fā)光粒子濃度。并且，應(yīng)該理解，即使在發(fā)光粒子的濃度變化速度隨時(shí)間變化的情況下，也能夠根據(jù)所掌握的發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為，來(lái)估計(jì)時(shí)時(shí)刻刻的發(fā)光粒子濃度值。
[0075]處理操作過(guò)程
[0076]在使用圖1的(A)所例示的光分析裝置I的本發(fā)明的光分析的實(shí)施方式中，具體地說(shuō)，執(zhí)行(I)含有發(fā)光粒子的樣本溶液的調(diào)制、(2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定和發(fā)光粒子的檢測(cè)、計(jì)數(shù)處理以及(3)濃度、反應(yīng)速度系數(shù)的計(jì)算等分析。
[0077](I)樣本溶液的調(diào)制
[0078]在本發(fā)明的光分析技術(shù)中，成為觀測(cè)對(duì)象的粒子如果是溶解的分子等在樣本溶液中分散并在溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，則可以是任意的，例如可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞、或金屬膠體、其它非生物學(xué)粒子等(樣本溶液典型的是水溶液，但是不限定于此，可以是有機(jī)溶劑及其它任意的液體。)。另外，作為觀測(cè)對(duì)象的粒子可以是其自身發(fā)光的粒子，或者，也可以是以任意方式附加了發(fā)光標(biāo)識(shí)(熒光分子、磷光分子、化學(xué)、生物發(fā)光分子)的粒子。另外，在本發(fā)明中，由于能夠追蹤發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為，因此例如濃度因結(jié)合離解反應(yīng)、分子間相互作用而變化的發(fā)光粒子、或發(fā)光特性因構(gòu)造變化而變化的發(fā)光粒子能夠用作觀測(cè)對(duì)象的粒子。
[0079](2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定和發(fā)光粒子的檢測(cè)
[0080]圖3的(A)?(B)以流程圖的形式表示使用圖1的(A)所例示的光分析裝置I執(zhí)行的本實(shí)施方式中的樣本溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定和發(fā)光粒子的檢測(cè)以及信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的測(cè)量的處理的一個(gè)例子。在該圖的例子中，如果清楚地描述，則按每個(gè)任意設(shè)定(設(shè)定得比較短)的解析時(shí)間間隔t執(zhí)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)、來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的檢測(cè)以及來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)的一系列處理，在檢測(cè)出發(fā)光粒子的信號(hào)的情況下，進(jìn)行該時(shí)間與此前檢測(cè)出發(fā)光粒子的信號(hào)的時(shí)間之間的時(shí)間間隔(信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔Tn或Τκη)的測(cè)量，優(yōu)選的是，實(shí)時(shí)地顯示信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔Tn或Τκη或者基于其值換算出的發(fā)光粒子濃度值或其指標(biāo)值。而且，在任意的時(shí)間內(nèi)連續(xù)地反復(fù)執(zhí)行所述處理。此外，應(yīng)該理解，下面記述的一系列的處理和結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)計(jì)算機(jī)18的處理動(dòng)作實(shí)現(xiàn)。
[0081](i)初始設(shè)定
[0082]參照?qǐng)D3的(A)，在具體的操作處理中，首先，在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺(tái)上之后，當(dāng)使用者對(duì)計(jì)算機(jī)18輸入光強(qiáng)度的測(cè)定、發(fā)光粒子的檢測(cè)以及信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的測(cè)量的開(kāi)始指示時(shí)，計(jì)算機(jī)18進(jìn)行在信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的測(cè)量中所參照的粒子數(shù)[間隔測(cè)量粒子數(shù)K](步驟10)和解析時(shí)間間隔t的讀入(步驟20)。間隔測(cè)量粒子數(shù)K可以是I以上的任意的整數(shù)。考慮到光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度(U)和尺寸(2r)，可以將解析時(shí)間間隔t適當(dāng)?shù)卦O(shè)定為與一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度相比足夠長(zhǎng)的任意的時(shí)間(>2r/u)。(為了盡可能地避免一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)在兩個(gè)以上的解析時(shí)間間隔t出現(xiàn)。)間隔測(cè)量粒子數(shù)K和解析時(shí)間間隔t可以是以任意方式由使用者輸入的值或在計(jì)算機(jī)18中適當(dāng)設(shè)定的值。
[0083](ii)發(fā)光粒子數(shù)的檢測(cè)
[0084]這樣，當(dāng)進(jìn)行了間隔測(cè)量粒子數(shù)K和解析時(shí)間間隔t的讀入時(shí)，如以下那樣，按每個(gè)解析時(shí)間間隔t反復(fù)執(zhí)行以下處理:在解析時(shí)間間隔t內(nèi)利用掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)定光強(qiáng)度，基于所測(cè)定出的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)及記錄信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間(步驟30);以及估算在步驟30中檢測(cè)出的發(fā)光粒子信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間間隔(步驟40)。此外，優(yōu)選的是，可以以使用者能夠視覺(jué)識(shí)別相對(duì)于時(shí)間經(jīng)過(guò)的變化的方式(例如表示相對(duì)于時(shí)間的變化的曲線圖顯示等)實(shí)時(shí)地將在步驟40中估算出的信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔或基于該信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔換算出的發(fā)光粒子濃度值或其指標(biāo)值顯示在計(jì)算機(jī)18的顯示器上(步驟45)。以下，詳細(xì)說(shuō)明步驟30?45的處理。
[0085](a)光強(qiáng)度的測(cè)定
[0086]圖3的(B)是以流程圖的形式表示步驟30中的處理過(guò)程的例子。參照該圖，在步驟30的處理過(guò)程中，首先一邊驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)(樣本溶液內(nèi)的掃描)，一邊在解析時(shí)間間隔t內(nèi)進(jìn)行光強(qiáng)度的測(cè)定(步驟100)。在所述處理中，典型的是，依照存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置(未圖示)中的程序(使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的過(guò)程、向光檢測(cè)區(qū)域照射激勵(lì)光的過(guò)程(僅在需要時(shí))以及在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的過(guò)程)，開(kāi)始進(jìn)行樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域處的激勵(lì)光的照射(僅在需要時(shí))和光強(qiáng)度的測(cè)定。當(dāng)開(kāi)始測(cè)定時(shí)，首先，在計(jì)算機(jī)18依照程序進(jìn)行的處理動(dòng)作的控制下，從光源2射出樣本溶液中的發(fā)光粒子的激勵(lì)波長(zhǎng)的光，并且反射鏡偏轉(zhuǎn)器17驅(qū)動(dòng)反射鏡7(檢電鏡)或者臺(tái)位置變更裝置17a驅(qū)動(dòng)臺(tái)來(lái)執(zhí)行光檢測(cè)區(qū)域的位置在皿10內(nèi)的移動(dòng)，與此同時(shí)，光檢測(cè)器16將依次接收到的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)后發(fā)送到計(jì)算機(jī)18，計(jì)算機(jī)18按照任意的方式根據(jù)發(fā)送來(lái)的信號(hào)生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。典型的是光檢測(cè)器16是能夠檢測(cè)一個(gè)光子的到來(lái)的超高靈敏度光檢測(cè)器，因此，光的檢測(cè)是以每隔規(guī)定的單位時(shí)間(BIN ??ΜΕ)、例如每隔1ys依次測(cè)量來(lái)到光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)的方式執(zhí)行的光子計(jì)數(shù)，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)可以是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0087]關(guān)于光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，為了定量地高精度地執(zhí)行根據(jù)測(cè)量出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光粒子的檢測(cè)，優(yōu)選的是將光強(qiáng)度的測(cè)量過(guò)程中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為比發(fā)光粒子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)、即布朗運(yùn)動(dòng)所引起的移動(dòng)速度快的值。在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的因布朗運(yùn)動(dòng)而進(jìn)行的移動(dòng)慢的情況下，如圖4的(A)示意性地描繪的那樣，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)，由此，光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(光檢測(cè)區(qū)域的激勵(lì)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外方降低。)，難以確定與各個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的有意義的光強(qiáng)度的變化(表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào))。因此，優(yōu)選的是如圖4的(B)所描繪的那樣，粒子大致直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域CV，由此，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，與各個(gè)粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的輪廓是與圖4的(C)最上部所例示那樣的激勵(lì)光強(qiáng)度分布大致相同的大致吊鐘狀，將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定得比粒子因布朗運(yùn)動(dòng)而進(jìn)行移動(dòng)的平均移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)快，使得能夠容易地確定各個(gè)發(fā)光粒子與光強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)。
[0088]具體地說(shuō)，具有擴(kuò)散系數(shù)D的發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而通過(guò)半徑r的光檢測(cè)區(qū)域(共焦區(qū)組織)時(shí)所需要的時(shí)間A τ根據(jù)以下的平均平方位移的關(guān)系式，
[0089](2r)2 = 6D.Δ τ...(5)
[0090]成為
[0091]Δ T = (2r)2/6D---(6)
[0092]因此，發(fā)光粒子因布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大致為
[0093]Vdif = 2r/Δ T = 3D/r...(7)。
[0094]因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參照所述Vdif設(shè)定為與其相比充分快的值。例如在預(yù)想發(fā)光粒子的擴(kuò)散系數(shù)是D = 2.0 X 10—1VVs左右的情況下，在設(shè)r為0.62μπι左右時(shí)，Vd i f為1.0 X I O—3m/s，因此，可以將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其1倍以上的例如15mm/s。此外，在發(fā)光粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知的情況下，可以設(shè)定各種光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，反復(fù)執(zhí)行用于找到光強(qiáng)度的變化的輪廓為預(yù)想的輪廓(典型的是與激勵(lì)光強(qiáng)度分布大致相同)的條件的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，來(lái)決定適合的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0095](b)與發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)的檢測(cè)
[0096]當(dāng)通過(guò)上述的處理得到解析時(shí)間間隔t的樣本溶液中的發(fā)光粒子的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，通過(guò)計(jì)算機(jī)18依照被存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序進(jìn)行處理，來(lái)執(zhí)行光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的與來(lái)自發(fā)光粒子的光對(duì)應(yīng)的信號(hào)的檢測(cè)。
[0097]在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，在一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡如圖4的(B)所示那樣是大致直線狀的情況下，與該粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)的光強(qiáng)度的變化具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)決定的)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布的大致吊鐘狀的輪廓(參照?qǐng)D4的(C)最上部)。因而，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，基本上可以在超過(guò)適當(dāng)設(shè)定的閾值的光強(qiáng)度所持續(xù)的時(shí)間寬度處于規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，判定為具有該光強(qiáng)度的輪廓的信號(hào)與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況對(duì)應(yīng)，進(jìn)行一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)。而且，超過(guò)閾值的光強(qiáng)度所持續(xù)的時(shí)間寬度不在規(guī)定的范圍內(nèi)的信號(hào)被判定為噪聲或異物的信號(hào)。另外，在能夠?qū)⒐鈾z測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為高斯分布時(shí)，即
[0098]I=A.exp(_2t2/a2)…(8)
[0099]在使式(8)擬合有意義的光強(qiáng)度的輪廓(能夠明確地判斷為不是背景的輪廓)而計(jì)算出的強(qiáng)度A和寬度a處于規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，可以將該光強(qiáng)度的輪廓判定為與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況對(duì)應(yīng)，進(jìn)行一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)。(強(qiáng)度A和寬度a處于規(guī)定的范圍外的信號(hào)被判定為噪聲或異物的信號(hào)，可以在其后的分析等中忽略。)
[0100]作為根據(jù)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行發(fā)光粒子的檢測(cè)的處理的更具體的方法的一個(gè)例子，首先對(duì)時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(圖4的(C)、最上部“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”)進(jìn)行平滑(平滑化)處理(圖3的(B)-步驟110、圖4的(C)的中上部“平滑”)。發(fā)光粒子所發(fā)出的光是概率性地釋放的，在微小的時(shí)間內(nèi)可能產(chǎn)生數(shù)據(jù)值的缺失，因此通過(guò)所述平滑處理，能夠忽略如上所述的數(shù)據(jù)值的缺失。例如可以通過(guò)移動(dòng)平均法進(jìn)行平滑處理。此外，也可以根據(jù)獲取光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度(