將專利文獻(xiàn)9?12所記載的能夠執(zhí)行掃描分子計(jì)數(shù)法或FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)與光檢測(cè)器組合所形成的裝置。參照該圖，光分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2?17以及用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的動(dòng)作并且獲取并解析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與普通的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，在此，使從光源2發(fā)射并在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發(fā)散的光而被發(fā)射，通過準(zhǔn)直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。典型的是，在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 IyL?幾十yL的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的激光在樣本容器或皿10內(nèi)的樣本溶液中形成焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激勵(lì)區(qū)域)。在樣本溶液中分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子、典型的是附加有熒光性粒子或熒光色素等發(fā)光標(biāo)識(shí)的粒子，當(dāng)所述發(fā)光粒子進(jìn)入到激勵(lì)區(qū)域時(shí)，在其間發(fā)光粒子被激勵(lì)而釋放出光。所釋放的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過針孔13，透過屏蔽濾波器14(在此，只選擇特定的波長(zhǎng)頻帶的光成分。)，被導(dǎo)入到多模光纖15，到達(dá)光檢測(cè)器16，在被轉(zhuǎn)換為按時(shí)間序列的電信號(hào)之后輸入到計(jì)算機(jī)18，以后面說明的方式進(jìn)行用于光分析的處理。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，在上述的結(jié)構(gòu)中，針孔13配置在與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置，由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域、即激勵(lì)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過針孔13，來自激勵(lì)區(qū)域以外的光被遮斷。圖1的(B)所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL?1fL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域(典型的是光強(qiáng)度以區(qū)域中心為頂點(diǎn)的高斯型分布。有效體積是以光強(qiáng)度為中心光強(qiáng)度的Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。)，被稱為共焦區(qū)組織。另外，在本發(fā)明中，由于能夠檢測(cè)來自一個(gè)發(fā)光粒子的光、例如來自一個(gè)熒光色素分子的微弱光，因此作為光檢測(cè)器16，優(yōu)選的是使用能夠在光子計(jì)數(shù)中使用的超高靈敏度的光檢測(cè)器。在光的檢測(cè)通過光子計(jì)數(shù)來進(jìn)行的情況下，以在規(guī)定時(shí)間內(nèi)按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間(BIN TIME)依次測(cè)量來到光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)的方式執(zhí)行光強(qiáng)度的測(cè)定。因而，在該情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。另外，在顯微鏡的臺(tái)(未圖示)設(shè)置用于移動(dòng)微板9的水平方向位置以變更要觀察的皿1的臺(tái)位置變更裝置17a。可以由計(jì)算機(jī)18控制臺(tái)位置變更裝置17a的動(dòng)作。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在存在多個(gè)檢體的情況下也能夠達(dá)成迅速的測(cè)量。
[0052]并且，在上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置通過光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)、即用于使焦點(diǎn)區(qū)域即光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。作為所述的用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以采用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉(zhuǎn)器17(移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置的方式)。所述反射鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與普通的激光掃描型顯微鏡中裝配的檢電鏡裝置相同?；蛘?，作為其它的方式，如圖1的(D)所例示的那樣，也可以使臺(tái)位置變更裝置17a進(jìn)行動(dòng)作以移動(dòng)注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，使樣光檢測(cè)區(qū)域在本溶液內(nèi)的相對(duì)位置移動(dòng)(移動(dòng)樣本溶液的絕對(duì)位置的方式)。另外，也可以與上述的通過變更光路來移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置的方式使光檢測(cè)區(qū)域沿著掃描軌道繞轉(zhuǎn)移動(dòng)同時(shí)地，通過移動(dòng)樣本溶液的位置的方式使樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的掃描軌道的位置沿著規(guī)定的移動(dòng)路徑移動(dòng)。無論在哪種方式的情況下，都在計(jì)算機(jī)18的控制下，與光檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)地驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a以達(dá)成所期望的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)圖案。光檢測(cè)區(qū)域的位置的掃描軌道可以是圓形、橢圓形等封閉的循環(huán)路徑，可以從圓形、橢圓形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇樣本溶液的位置的移動(dòng)軌跡(可以設(shè)為在計(jì)算機(jī)18中的程序中能夠選擇各種移動(dòng)圖案。)。此外，雖然沒有圖示，但也可以通過使物鏡8或臺(tái)上下移動(dòng)來使光檢測(cè)區(qū)域的位置在上下方向上移動(dòng)。
[0053]在作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子通過多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在這種情況下，只在激勵(lì)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)釋放光，因此可以去除針孔13。另外，在作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子不通過激勵(lì)光而通過化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光的情況下，可以省略用于生成激勵(lì)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。在發(fā)光粒子通過磷光或散射而發(fā)光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。并且，可以在光分析裝置I中如圖示那樣設(shè)置多個(gè)激勵(lì)光源2，可以設(shè)為能夠根據(jù)發(fā)光粒子的激勵(lì)波長(zhǎng)而適當(dāng)?shù)剡x擇激勵(lì)光的波長(zhǎng)。同樣地，也可以具備多個(gè)光檢測(cè)器16，在樣本中包含有波長(zhǎng)不同的多種發(fā)光粒子的情況下，可以設(shè)為能夠根據(jù)其波長(zhǎng)分別檢測(cè)來自它們的光。
[0054]計(jì)算機(jī)18具備CPU和存儲(chǔ)器，通過CPU執(zhí)行各種運(yùn)算處理來執(zhí)行本發(fā)明的步驟。此夕卜，各步驟也可以由硬件構(gòu)成。本實(shí)施方式中說明的處理的全部或一部分可以由計(jì)算機(jī)18使用存儲(chǔ)有用于實(shí)現(xiàn)那些處理的程序的計(jì)算機(jī)可讀取的存儲(chǔ)介質(zhì)來執(zhí)行。即，計(jì)算機(jī)18可以通過讀出存儲(chǔ)在存儲(chǔ)介質(zhì)中的程序來執(zhí)行信息的加工、運(yùn)算處理，由此實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的處理步驟。在此，計(jì)算機(jī)可讀取的記錄介質(zhì)可以是磁盤、磁光盤、⑶_R0M、DVD-R0M、半導(dǎo)體存儲(chǔ)器等，或者也可以將上述的程序通過通信線路傳送到計(jì)算機(jī)并由接收到該傳送的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序。
[0055]本發(fā)明的光分析技術(shù)的原理
[0056]如“
【發(fā)明內(nèi)容】
，，一欄所記載的那樣，如果清楚地進(jìn)行描述，則在本發(fā)明的光分析技術(shù)中，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中依次測(cè)量發(fā)光粒子的信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔，使用依次測(cè)量出的信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔來確定發(fā)光粒子濃度或濃度變化速度或它們的指標(biāo)值。以下，對(duì)本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法以及使用信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔來確定發(fā)光粒子濃度或濃度變化速度或它們的指標(biāo)值的原理進(jìn)行說明。
[0057]1.掃描分子計(jì)數(shù)法的原理
[0058]在“掃描分子計(jì)數(shù)法”(專利文獻(xiàn)9?12)中，基本上，驅(qū)動(dòng)用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)(反射鏡偏轉(zhuǎn)器17)來變更光路，或者移動(dòng)注入了樣本溶液的容器1 (微板9)的水平方向的位置，從而如圖2的(A)示意性地描述的那樣，一邊使光檢測(cè)區(qū)域CV的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過光檢測(cè)區(qū)域CV掃描樣本溶液內(nèi)，一邊執(zhí)行光檢測(cè)。這樣，例如在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)的期間(圖中為時(shí)間to?t2)，在通過存在一個(gè)發(fā)光粒子的區(qū)域時(shí)(tl)，從發(fā)光粒子釋放出光，如在圖2的(B)中所描繪的那樣，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度(Em)的脈沖狀的信號(hào)。這樣，執(zhí)行上述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，逐一檢測(cè)其間出現(xiàn)的如圖2的(B)所例示的脈沖狀的信號(hào)(有意義的光強(qiáng)度)，由此逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光粒子，通過對(duì)其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠獲取在所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)存在的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、或者與濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。在所述的掃描分子計(jì)數(shù)法的原理中，不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算那樣的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，而是逐個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，因此即使在要觀測(cè)的粒子的濃度低至無法通過FCS、FIDA等以足夠的精度進(jìn)行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。
[0059]2.使用信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的發(fā)光粒子濃度的確定
[0060]與圖9關(guān)聯(lián)地，如已經(jīng)記述的那樣，在專利文獻(xiàn)9?12所記載的掃描分子計(jì)數(shù)法中，如上述的那樣在固定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)執(zhí)行光測(cè)量或者執(zhí)行光測(cè)量直到固定的檢測(cè)數(shù)為止，基于固定的測(cè)量時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)數(shù)或固定的檢測(cè)數(shù)的檢測(cè)需要的測(cè)量時(shí)間來估算樣本溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的濃度值或其指標(biāo)值。在所述結(jié)構(gòu)中，為了高精度地或有效地進(jìn)行光測(cè)量以及發(fā)光粒子的濃度檢測(cè)，優(yōu)選的是發(fā)光粒子的濃度是準(zhǔn)靜態(tài)或穩(wěn)定的，且能夠在某種程度上預(yù)測(cè)樣本溶液內(nèi)的發(fā)光粒子的濃度值。
[0061]另外，如圖2的(C)示意性地描繪的那樣，在通過掃描分子計(jì)數(shù)法獲得的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，發(fā)光粒子濃度越高，則發(fā)光粒子的信號(hào)的產(chǎn)生頻率越大，因此信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔越窄。即，例如在發(fā)光粒子濃度隨時(shí)間增大的情況下，如圖示那樣，信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔Tj為
[0062]Ti>Tii>Tiii>Tiv>Tv……(I)。
[0063]因而，通過使用發(fā)光粒子的信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔，能夠進(jìn)行發(fā)光粒子濃度的計(jì)算，并且通過依次追蹤信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間的間隔，還能夠追蹤發(fā)光粒子濃度的變化。具體地說，如下述那樣賦予發(fā)光粒子濃度與信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的關(guān)系。即，如圖2的(D)示意性地描繪的那樣，在樣本溶液中的發(fā)光粒子濃度為C時(shí)，在與掃描方向垂直的方向的截面積S的光檢測(cè)區(qū)域CV以速度u移動(dòng)時(shí)間τ的期間，被光檢測(cè)區(qū)域CV包含的(即，檢測(cè)出的)發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)P為
[0064]P = CSux = CJir2UT-..(2) 0
[0065]在此，光檢測(cè)區(qū)域CV的截面近似為半徑r的圓。因而，檢測(cè)一個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)需要的時(shí)間τ/Ρ、即在檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子之后直至檢測(cè)出下一個(gè)發(fā)光粒子為止的時(shí)間間隔(單個(gè)粒子的信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔)Tj( = VP)通過下式給出。
[0066]Tj = l/(C3ir2u)---(3)
[0067]因此，通過測(cè)量信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔Tj，發(fā)光粒子濃度C被估算為
[0068]C=l/(Tj3ir2u)---(4)0
[0069]此外，發(fā)光粒子的檢測(cè)過程、即信號(hào)的產(chǎn)生過程是概率性的，在單個(gè)粒子的信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔的偏差變大時(shí)，如圖2的(C)所示那樣，依次執(zhí)行信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔Tj的測(cè)量以及向發(fā)光粒子的濃度值的換算，通過參照依次得到的發(fā)光粒子的濃度值能夠在某種程度上抵消執(zhí)行光測(cè)量的期間的發(fā)光粒子的濃度值和其時(shí)間變化的行為中的偏差。另外，信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔也可以是產(chǎn)生規(guī)定數(shù)量的粒子的信號(hào)的時(shí)間的間隔。即，可以是從某個(gè)粒子的信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間直到第k個(gè)粒子的信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間為止的時(shí)間間隔TKj，在該情況下，發(fā)光粒子濃度C通過下式給出。
[0070]C = k/ (TKj3rr2u)...(4a)
[0071]在式(4a)的情況下，時(shí)間分辨率下降，但是能夠期待抑制值的偏差。K可以是例如2?50等的整數(shù)。
[0072]如上所述，根據(jù)依次測(cè)量信號(hào)產(chǎn)生時(shí)間間隔來估算發(fā)光粒子濃度的值的方式，首先，能夠掌握發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為。因而，在發(fā)光粒子濃度隨時(shí)間變化的系統(tǒng)中，能夠沿著時(shí)間的經(jīng)過追蹤發(fā)光粒子濃度。由此，使用對(duì)追蹤所得到的發(fā)光粒子濃度值進(jìn)行擬合等處理能夠確定發(fā)光粒子濃度的變化速度或發(fā)光粒子的相關(guān)的反應(yīng)的反應(yīng)速度。所述的濃度變化速度或反應(yīng)速度在與發(fā)光粒子濃度變化的機(jī)理有關(guān)的分析或考察中是有用的信息。
[0073]另外，根據(jù)上述的方式，能夠掌握發(fā)光粒子濃度的時(shí)間變化的行為，因此應(yīng)該理解到不需要預(yù)先掌握發(fā)光粒子的濃度水平來設(shè)定用于光測(cè)量的固定