牽 牛子1200g，石韋1100g，姜黃1200g，虎杖1200g，牛膝1200g，雞內(nèi)金1100g，赤芍1100g，丹 參1200g，陳皮1100g，豬苓1100g，馬鞭草1100g，黃芩1200g，半邊蓮1200g，金銀花1100g， 白花蛇舌草1200g，蒲公英1100g。。按照所述份數(shù)先將王不留行、姜黃用水蒸氣法蒸餾，得 到結(jié)晶物，作為組分1備用；取蒸餾后的藥渣混合剩余原料加入5-10倍量的60-90%乙醇 浸泡1-2小時(shí)，加熱提取2次，每次1-2小時(shí)，去上清液，合并提取液，80-120目濾過(guò)，再經(jīng)截 流分子量為5000-10000的超濾柱超濾，超濾液減壓濃縮相對(duì)密度為80°C時(shí)1. 36的浸膏， 加熱濃縮，30分鐘~45分鐘，將濃縮液靜置成浸膏狀，藥糊繼續(xù)加熱濃縮至浸膏狀，靜置備 用，成為組分2 ;將蒸餾提取的組分1和乙醇提取的組分2混合，壓片制成片劑。
[0081] 藥理學(xué)毒性試驗(yàn)
[0082] -、試驗(yàn)材料：
[0083](一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠NIH，體重25-28g，雌雄各半；大鼠Wistar體重130-160g，雌 雄各半，大鼠、小鼠的飼料由山東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
[0084](二）受試藥物：
[0085] 1、本發(fā)明藥物：實(shí)施例2所制的丸劑，三批量等量混合物實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水稀釋?xiě)?yīng) 用。
[0086] 2、陽(yáng)性對(duì)照藥物：金匱腎氣丸，市售。
[0087] 二、試驗(yàn)方法及結(jié)果：
[0088] (1)取體重25_28g的健康小鼠80只，雌、雄各半，按性別和體重分別分成四組，每 組20只。1、2、3組服用本發(fā)明藥物，劑量分別為8. 6g生藥/kg/d，6. 4g生藥/kg/d，4. 2g生 藥/kg/d，第4組服用陽(yáng)性對(duì)照藥金匱腎氣丸，劑量為6g生藥/kg/d，連用15天。
[0089] 試驗(yàn)結(jié)果：1、2、3組小鼠比4組小鼠性興奮度明顯增強(qiáng)，1、2、3組小鼠的交配次數(shù) 比4組小鼠的交配次數(shù)平均每日增加3次。
[0090] 試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的興奮作用，所以本發(fā)明藥物對(duì) 于調(diào)節(jié)人體機(jī)能平衡、益氣、補(bǔ)血、延緩衰老增強(qiáng)新陳代謝，精神疲憊，性機(jī)能減退都有治療 依據(jù)。
[0091 ] 本發(fā)明動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)
[0092] -、試驗(yàn)材料
[0093] (一）動(dòng)物小鼠NIH種雌雄各半，體重20_22g，由山東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。
[0094](二）受試藥物：本發(fā)明所制的口服液，用蒸餾水稀釋成混懸液。
[0095]二、試驗(yàn)方法及結(jié)果：
[0096]小鼠最大耐受量測(cè)定：取健康小鼠32只，雌雄各半，在24小時(shí)之內(nèi)分三組，灌胃腸 每次0. 6ml/只，總重量1. 8ml，相當(dāng)于原生藥4. 0g，SP100g生藥/kg/d，相當(dāng)于臨床65公斤 人的857倍。小鼠給藥后按常規(guī)飼料12天未見(jiàn)動(dòng)物死亡及未出、現(xiàn)毒性反應(yīng)。因此證明， 本發(fā)明藥物無(wú)毒副作用，臨床應(yīng)用安全可靠。
[0097] 本發(fā)明藥物組合物的動(dòng)物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)
[0098] 一、試驗(yàn)材料及方法
[0099] (一）受試藥物：本發(fā)明實(shí)施例所制的口服液劑。
[0100] (二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，健康大鼠Wistar，體重100-130g，140只雌雄各半，按性別及體重 隨機(jī)分組，四組，每組35只。1、2、3組服用受試藥物，劑量分別為9. 6/kg/d，6. 4/kg/d，3. 2/ kg/d。4組對(duì)照給相應(yīng)體積量的蒸餾水、大鼠均灌胃腸給藥，每組一次連用6個(gè)月，處死一 半，余下1/2停藥觀察12天全部死亡。
[0101] 二、測(cè)試指標(biāo)
[0102](一）一般狀況包括體重、飲食、情緒、活動(dòng)能量。
[0103](二）血象檢查：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血象等，血紅蛋白定量計(jì) 數(shù)。
[0104](三）生化檢查、血清蛋白定量、膽固醇、血糖定量。
[0105](四）病理組織檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)果后取半數(shù)動(dòng)物稱重，斷頭處死，取血，同時(shí)解剖心、 肝、腎、肺、腦、脾、胃腸、膀胱、腎上腺做病理組織檢查。
[0106] 三、試驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)表明，用本發(fā)明大劑量灌腸六個(gè)月，對(duì)大鼠的 生長(zhǎng)、體重增加、對(duì)腦、肝、腎功能均無(wú)毒副作用。對(duì)大鼠的各組織器官、循環(huán)系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)損 害改變，用藥組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。說(shuō)明本發(fā)明藥物具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、益氣、補(bǔ)血、延緩 衰老增強(qiáng)新陳代謝等藥效，無(wú)毒性。
[0107]藥物與臨床實(shí)驗(yàn)
[0108] 泌尿系結(jié)石是泌尿外科常見(jiàn)病，國(guó)內(nèi)發(fā)病率較高。雖然目前已有多種手段應(yīng)用于 臨床治療，且取得良好效果，如體外沖擊波碎石、輸尿管鏡、經(jīng)皮腎鏡、超聲碎石、鈥激光碎 石等，但術(shù)后結(jié)石殘留率和結(jié)石復(fù)發(fā)率仍居高不下。國(guó)內(nèi)已有較多關(guān)于中藥在防治腎結(jié)石 方面的報(bào)道，本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證本發(fā)明對(duì)泌尿系結(jié)石的預(yù)防作用，現(xiàn)報(bào)道 如下。
[0109] 材料與方法
[0110] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0111] 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠90只，體重180~220g，普通級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬）2007-0005。
[0112] 1. 2實(shí)驗(yàn)藥物成石液：按每升液體中含乙二醇12. 5g+氯化銨10g配制；本發(fā)明中 藥，方劑：王不留行15g，金錢草14g，金櫻子llg，海金沙12g，冬瓜仁12g，炒牽牛子12g，石 韋12g，姜黃13g，虎杖12g，牛膝12g，雞內(nèi)金llg，赤芍llg，丹參12g，陳皮llg，豬苓llg，馬 鞭草llg，黃芩12g，半邊蓮12g，金銀花llg，白花蛇舌草12g，蒲公英llg。為煎劑型，均購(gòu) 自山東青島。乙二醇購(gòu)自無(wú)錫市佳妮化工廠；氯化銨購(gòu)自浙江衢州巨化試劑有限公司；枸 櫞酸鉀購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站。
[0113] 1. 3實(shí)驗(yàn)儀器離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡、勻漿機(jī)、紫外線分光光度計(jì)。
[0114] 2動(dòng)物分組與藥物干預(yù)將90只大鼠隨機(jī)分為5組，即陽(yáng)性對(duì)照組（模型組，A組）、 本發(fā)明高劑量（B組）、本發(fā)明中劑量（C組）、本發(fā)明低劑量組（D組）、療效對(duì)照組（枸櫞酸 鉀組，E組），每組18只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d。
[0115] 所有動(dòng)物每天給予成石液10ml(自由攝?。?水30ml(自由攝?。組給予生理 鹽水，每只動(dòng)物每天2ml灌胃；B組給予本發(fā)明免煎劑，每只動(dòng)物0. 6g/d;C組給予本發(fā)明免 煎劑，每只動(dòng)物〇. 3g/d;D組給予本發(fā)明免煎劑，每只動(dòng)物0.lg/d;E組給予枸櫞酸鉀，每只 動(dòng)物0.5g/d。以上各藥均配置成2ml液體灌胃。給藥劑量按成人用量計(jì)算，見(jiàn)表1。
[0116] 表1動(dòng)物給藥量計(jì)算表
[0117]
[0118] 3觀察指標(biāo)和方法
[0119] 飼養(yǎng)4周后，同期取標(biāo)本。（1)接取尿液，涂片觀察尿中草酸鈣結(jié)晶，每張涂片取5 個(gè)高倍視野，取平均值評(píng)估。判定標(biāo)準(zhǔn)：(_):高倍視野中未見(jiàn)草酸鈣結(jié)晶；（<+):〇~10/ HP; (+) :10 ~20/HP; (++) :20 ~30/HP; (+++) :> 30/HP。
[0120] (2)用10%水合氯醛1ml腹腔注射，麻醉大鼠成功后即剖腹取雙腎，所有左側(cè)腎固 定后常規(guī)切片染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎草酸鈣結(jié)晶形成情況。判定標(biāo)準(zhǔn)：(_):高倍 視野中未見(jiàn)草酸鈣結(jié)晶；（+):腎皮質(zhì)和髓質(zhì)內(nèi)結(jié)晶為主，約0~40/HP;(++):腎乳頭和腎 盂內(nèi)結(jié)晶為主，約>40/HP。（3)計(jì)數(shù)平均每個(gè)高倍視野內(nèi)右腎草酸鈣結(jié)晶數(shù)量。方法：取 右腎1/3組織固定后常規(guī)切片染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片觀察5個(gè)高倍視野計(jì) 數(shù)草酸鈣結(jié)晶數(shù)量，得平均值。（4)右腎2/3組織稱重后，加入lmol/LHCllOml浸泡4h后 用內(nèi)切式組織勻漿器制備組織勻漿，3OOOr/min離心20min，取上清液用變色酸比色法測(cè) 草酸含量。
[0121] 4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11. 5統(tǒng)計(jì)軟件包，對(duì)于右草酸鈣結(jié)晶數(shù)量和草酸含量指 標(biāo)，采用均數(shù)比較的t-檢驗(yàn)；對(duì)于尿檢和半定量法判定左腎草酸鈣結(jié)晶情況，采用非參數(shù) 檢驗(yàn)（秩和檢驗(yàn)）的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；對(duì)于成石率的比較，采用pearsonChi-square 檢驗(yàn)。
[0122] 結(jié)果
[0123] 1動(dòng)物存活情況飼養(yǎng)給藥過(guò)程中，B組和D組各有1只大鼠死亡，故取得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 的共有88只大鼠。
[0124] 2尿中草酸鈣結(jié)晶檢測(cè)
[0125] 草酸鈣結(jié)晶在普通光學(xué)顯微鏡下較易觀察，表現(xiàn)為無(wú)色方形閃爍發(fā)光的八面體， 有2條對(duì)角線相互交叉，有時(shí)呈現(xiàn)菱形，偶為餅形或啞鈴型。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。
[0126] 表2各組半定量法尿中草酸鈣結(jié)晶檢測(cè)情況（只）
[0127]
[0128] 由表2可見(jiàn)B、C、D3組尿中草酸鈣結(jié)晶排泄明顯高于A組（陽(yáng)性對(duì)照組），Pb_a= 0. 004 < 0. 01 ;Pc-a= 0. 003 < 0. 01 ;Pd-a= 0. 01 ;尚不能認(rèn)為E組尿中草酸鈣結(jié)晶排泄 高于A組Pe_a= 0? 291。
[0129] 3左腎草酸鈣結(jié)晶檢測(cè)腎組織切片HE染色后，草酸鈣結(jié)晶表現(xiàn)為：淡藍(lán)色晶體， 不規(guī)則，折光性強(qiáng)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。
[0130] 表3各組半定量法左腎草酸鈣結(jié)晶檢測(cè)情況（只）
[0131]
[0133]由表3可見(jiàn)B、C、D、E4組左腎草酸鈣結(jié)晶明顯少于A組，Pb-a= 0. 008 < 0. 01;Pc-a= 0? 01 ;Pd-a= 0? 017 < 0? 05 ;Pe-a= 0? 041。尚不能認(rèn)為B、C、D3 組左腎草酸鈣結(jié)晶 與E組（療效對(duì)照組）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pb-e= 0? 650,Pc-e= 0? 773,Pd-e= 0? 764)。 另外，A組成石率為77. 8%;B組成石率為41. 2%，明顯低于A組，Pb-a= 0. 027 < 0. 05;C 組成石率為44. 4%，明顯低于A組，Pc-a= 0. 04 < 0. 05 ;D組成石率為41. 2%，明顯低于A組，卩(11 = 0.027 <0.05出組成石率為44.4%，明顯低于4組，？61 = 0.04<0.05。由 此可