驗室研究等）。
【附圖說明】
[0045] 圖1本發(fā)明的設(shè)計流程圖。首先提取DNA模板，然后進行雜交、連接反應(yīng)，并對產(chǎn)物 進行純化，之后進行PCR擴增并采用高通量測序技術(shù)對文庫進行測序，最后分析測序數(shù)據(jù)。
[0046] 圖2目標檢測區(qū)域的詳細亞區(qū)劃分。Y染色體AZF區(qū)可詳細劃分為AZFa、AZFbc區(qū) 的y、b、g、r、t、grey等不同的亞區(qū)，有的亞區(qū)可能存在順式重復(fù)或回文重復(fù)區(qū)域，例如gl、 g2、g3三個重復(fù)區(qū)。
[0047] 圖3實施例1的拷貝數(shù)變化信息。
[0048] 圖4實施例2的拷貝數(shù)變化信息。
[0049] 圖5實施例3的拷貝數(shù)變化信息。
[0050] 圖6實施例4的拷貝數(shù)變化信息。
【具體實施方式】
[0051] 下面將對本發(fā)明實施例中的方案進行清楚完整的描述，但本發(fā)明并不受其限制， 所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，基于本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員所 獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明的保護范圍；同樣地，實施例的附圖僅僅是本發(fā)明一 部分實施例的附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些附圖所獲得的其他附圖，也都屬于本發(fā)明的 保護范圍。
[0052] 下列實施例中使用的雜交引物為表1所示的引物組合物（其中，上游引物序列分 別為SEQ ID NO: 1-148,中游引物序列分別為SEQ ID NO: 149-296,下游引物序列分別為SEQ ID NO: 297-444)，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議 的條件。
[0053] 表1雜交引物序列
[0054] CN 105176992 A 說明書 5/21 頁

CN 105176992 A 說明書 7/21 頁
CN 105176992 A 說明書 8/21 頁
[0058] 實施例1毛囊樣本檢測AZF區(qū)微缺失
[0059] 一、材料：
[0060] 1.標本：樣本來源為合作醫(yī)院接診的一位男性少精癥患者的毛囊樣本，經(jīng)醫(yī)院采 用多重PCR技術(shù)檢測為Y染色體AZFc區(qū)缺失。
[0061] 2.試劑：微量基因組DNA提取試劑盒、末端補平試劑盒、Qubit? dsDNA HS分析 試劑盒、生物素、標記酶、標記酶反應(yīng)液、超純水、雜交緩沖液、雜交引物、DNA溶解液（Low TE)、連接酶、連接酶反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、標簽接頭、洗滌液、XP磁珠、異丙醇、無水乙醇、 DynabeadsB' MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease_free ffater(not DEPC-treated) >Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0062] 3.器材：高速冷凍離心機、水浴鍋、超聲打斷儀Covaris M220、磁力架、PCR儀、Ion OneTouch? 2Instrument、Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM測序儀、Ion 316? Chip v2、 四維旋轉(zhuǎn)混合儀、迷你離心機、漩渦振蕩器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0063] 二、操作步驟：
[0064] 1.提取毛囊樣本中的基因組DNA。超聲打斷成150bp大小片段，按照下表配制體 系，室溫靜置20分鐘補平末端。
[0066] 將完成補平的體系加入360 μ L XP磁珠，混勻后室溫放置5分鐘，磁吸待液體澄清 后棄上清，不取下離心管，加入75%乙醇500 μ L，來回傾斜磁力架沖洗磁珠表面5~10次， 吸棄液體后再重復(fù)清洗一遍。取下離心管瞬時離心，重新放置在磁力架上至液體澄清后棄 掉上清液，晾干磁珠，加入DNA溶解液，混勻后磁吸收集上清。
[0067] 2. DNA 標記
[0068] 按照下表制備反應(yīng)體系，混勻后37°C溫浴1小時。
[0070] 3.標記產(chǎn)物的純化
[0071] 加等體積異丙醇（預(yù)冷_20°C )，_70°C放置1小時以上或_20°C放置過夜， 4°C 13000rpm離心40min。用300 μ L新配制的75%乙醇洗滌沉淀，4°C 13000rpm離心8min， 棄上清。共洗兩次。室溫晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0072] 4.雜交
[0073] 準備Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室溫孵育）漩禍振蕩大于 30s徹底混勻，取10 μ L磁珠移到一個新的PCR管中，磁吸3min，棄上清5 μ L，備用。按照下 表混合反應(yīng)體系，輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡），PCR儀上95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰 置 IOmin0
[0075] 冰置結(jié)束后，瞬時離心，將反應(yīng)液加入準備好的Myone Cl磁珠中，漩渦振蕩30s混 勻，避免有氣泡，室溫22~25°C (室溫不能低于20°C，最高不能超過27°C )輕輕旋轉(zhuǎn)混合 2h〇
[0076] 5.雜交產(chǎn)物的純化
[0077] 將PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液體澄清后棄上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 滌3次。加入45 μ L DNA溶解液重懸磁珠。
[0078] 6·連接
[0079] 將下表的連接體系置于PCR儀上，37°C反應(yīng)1小時。
[0081] 7.連接產(chǎn)物的純化
[0082] 將完成連接反應(yīng)的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液體澄清后棄上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管。共洗滌2次。 加入23 μ L DNA溶解液重懸磁珠，PCR儀上95°C變性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液體至新的PCR管中。
[0083] 8. PCR
[0084] 按照下表加反應(yīng)體系：
CN 105176992 A 說明書 11/21 頁
[0087] 按照下述程序進行反應(yīng):
[0089] 9. PCR產(chǎn)物的純化
[0090] 將XP磁珠提前30min取出平衡至室溫，漩渦振蕩30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好標記。取45 μ L PCR產(chǎn)物加入20 μ L XP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸3~5min，待液體徹底澄清后取上清62 μ L到97 μ LXP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸待液體澄清后棄上清，不取下離心管，加入75 %乙醇150 μ L，來回傾斜磁力架，使液體 沖洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin內(nèi)吸棄液體。共洗兩次。取下離心管瞬時離心， 再重新放置在磁力架上，至液體澄清時棄掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混勻 后室溫放置3~5min，磁吸后將上清（即文庫）轉(zhuǎn)移至新的EP管中。
[0091] 10.文庫測序
[0092] 取2以1^文庫用如1^丨2.0進行濃度測定。將文庫稀釋至18?111〇1/^1^經(jīng)用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制備成乳液PCR樣本，Ion OneTouchTM ES上進行產(chǎn)物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上測序。
[0093] 11.數(shù)據(jù)分析
[0094] 首先過濾低質(zhì)量測序序列，去掉小于70bp的測序片段，將過濾后的序列比對到 148個用來設(shè)計引物的參考基因組序列片段，計算這148個目標區(qū)域的總測序序列條數(shù)N和 各自的測序序列條數(shù)Ni。
[0095] 利用10個內(nèi)部參考區(qū)域的引物序列條數(shù)的均值N0,將138個AZF區(qū)域的引物序列 條數(shù)進行均一化，公式為：Ci = Ni/N0。
[0096] 根據(jù)每個引物的Ci值，計算AZF區(qū)劃分的每個小區(qū)的均值，即得到待檢測樣本AZF 區(qū)各小區(qū)的真實拷貝數(shù)信息，例如g區(qū)有10個引物位點，對應(yīng)的Ci值分別為gl、g2、g3… gl〇,則g區(qū)拷貝數(shù)
[0097] 通過待檢測樣本AZF區(qū)各小區(qū)的真實拷貝數(shù)信息與理論值的變化比較，發(fā)現(xiàn)AZFc 區(qū)內(nèi)g、r區(qū)拷貝數(shù)變?yōu)?, b區(qū)拷貝數(shù)減少一半，而AZFa和AZFb區(qū)拷貝數(shù)不變（如圖3所 示）。檢測結(jié)論為該樣本Y染色體AZF區(qū)發(fā)生b2/b4缺失。
[0098] 實施例2外周血樣本檢測AZF區(qū)微缺失
[0099] -、材料：
[0100] 1.標本：樣本來源為合作醫(yī)院接診的一位男性少精癥患者的外周血樣本，經(jīng)醫(yī)院 采用多重PCR技術(shù)檢測為Y染色體AZFc區(qū)部分缺失。
[0101] 2.試劑：血漿DNA提取試劑盒、Qubit? dsDNA HS分析試劑盒、生物素、標記 酶、標記酶反應(yīng)液、超純水、雜交緩沖液、雜交引物、DNA溶解液（Low TE)、連接酶、連 接酶反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、標簽接頭、洗滌液、XP磁珠、異丙醇、無水乙醇、Dynabeads? MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease-free Water (not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0102] 3.器材：高速冷凍離心機、水浴鍋、磁力架、PCR儀、Ion OneTouch? 2Instrument、 Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM 測序儀、Ion 316? Chip v2、四維旋轉(zhuǎn)混合儀、迷你離 心機、漩渦振蕩器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0103] 二、操作步驟：
[0104] 1.用血漿DNA提取試劑盒提取血漿DNA。
[0105] 2. DNA 標記
[0106] 按照下表制備反應(yīng)體系，混勻后37°C溫浴1小時。
[0108] 3.標記產(chǎn)物的純化
[0109] 加等體積異丙醇（預(yù)冷_20°C )，-70°C放置1小時以上或-20°C放置過夜， 4°〇13000印111離心40111；[11。用300 4 1^新鮮配制的75%乙醇洗滌沉淀，4°0