、AZFb、AZFc區(qū)拷貝數(shù)不變（如圖5所示）。檢測(cè)結(jié)論為該樣本Y染色體AZF區(qū)正常， 造成患者少精癥狀的原因是AZF區(qū)之外的遺傳因素或非遺傳因素。
[0174] 實(shí)施例4外周血樣本檢測(cè)AZF區(qū)微缺失
[0175] -、材料：
[0176] 1.標(biāo)本：樣本來(lái)源為合作醫(yī)院接診的一位男性少精癥患者的外周血樣本，經(jīng)醫(yī)院 采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)為Y染色體AZFb+c區(qū)缺失。
[0177] 2.試劑：血液基因組DNA提取試劑盒、末端補(bǔ)平試劑盒、Qubitf) dsDNA HS分析 試劑盒、生物素、標(biāo)記酶、標(biāo)記酶反應(yīng)液、超純水、雜交緩沖液、雜交引物、DNA溶解液（Low TE)、連接酶、連接酶反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、標(biāo)簽接頭、洗滌液、XP磁珠、異丙醇、無(wú)水乙醇、 Dynabcads?: MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease-free Water(not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0178] 3.器材：高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋、超聲打斷儀Covaris M220、磁力架、PCR儀、Ion OneTouch? 2Instrument、Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM測(cè)序儀、Ion 316? Chip v2、 四維旋轉(zhuǎn)混合儀、迷你離心機(jī)、漩渦振蕩器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0179] 二、操作步驟：
[0180] 1.提取外周血樣本中的基因組DNA。超聲打斷成150bp大小片段，按照下表配制 體系，室溫靜置20分鐘補(bǔ)平末端。
[0182] 將完成補(bǔ)平的體系加入360 μ L XP磁珠，混勻后室溫放置5分鐘，磁吸待液體澄清 后棄上清，不取下離心管，加入75%乙醇500 μ L，來(lái)回傾斜磁力架沖洗磁珠表面5~10次， 吸棄液體后再重復(fù)清洗一遍。取下離心管瞬時(shí)離心，重新放置在磁力架上至液體澄清后棄 掉上清液，晾干磁珠，加入DNA溶解液，混勻后磁吸收集上清。
[0183] 2. DNA 標(biāo)記
[0184] 按照下表制備反應(yīng)體系，混勻后37°C溫浴1小時(shí)。
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[0186] 3.標(biāo)記產(chǎn)物的純化
[0187] 加等體積異丙醇（預(yù)冷_20°C )，-70°C放置1小時(shí)以上或-20°C放置過(guò)夜， 4°〇13000印111離心40111；[11。用300 4 1^新鮮配制的75%乙醇洗滌沉淀，4°0 13000印1]1離心 8min，棄上清。共洗兩次。室溫晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0188] 4.雜交
[0189] 準(zhǔn)備Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室溫孵育）漩禍振蕩大于 30s徹底混勻，取10 μ L磁珠移到一個(gè)新的PCR管中，磁吸3min，棄上清5 μ L，備用。按照下 表混合反應(yīng)體系，輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡），PCR儀上95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰 置 IOmin0
[0191] 冰置結(jié)束后，瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液加入準(zhǔn)備好的Myone Cl磁珠中，漩渦振蕩30s混 勻，避免有氣泡，室溫22~25°C (室溫不能低于20°C，最高不能超過(guò)27°C )輕輕旋轉(zhuǎn)混合 2h〇
[0192] 5.雜交產(chǎn)物的純化
[0193] 將PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液體澄清后棄上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 滌3次。加入45 μ L DNA溶解液重懸磁珠。
[0194] 6.連接
[0195] 將下表的連接體系置于PCR儀上，37°C反應(yīng)1小時(shí)。
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[0197] 7.連接產(chǎn)物的純化
[0198] 將完成連接反應(yīng)的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液體澄清后棄上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管。共洗滌2次。 加入23 μ L DNA溶解液重懸磁珠，PCR儀上95°C變性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液移至新的PCR管中。
[0199] 8. PCR
[0200] 按照表格加反應(yīng)體系。
[0204] 9. PCR產(chǎn)物的純化
[0205] 將XP磁珠提前30min取出平衡至室溫，漩渦振蕩30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好標(biāo)記。取45 μ L PCR產(chǎn)物加入20 μ L XP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸3~5min，待液體徹底澄清后取上清62 μ L到97 μ L XP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸待液體澄清后棄上清，不取下離心管，加入75 %乙醇150 μ L，來(lái)回傾斜磁力架，使液體 沖洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin內(nèi)吸棄液體。共洗兩次。取下離心管瞬時(shí)離心， 再重新放置在磁力架上，至液體澄清時(shí)棄掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混勻 后室溫放置3~5min，磁吸后將上清（即文庫(kù)）轉(zhuǎn)移至新的EP管中。
[0206] 10.文庫(kù)測(cè)序
[0207] 取2以1^文庫(kù)用〇1*^2.0進(jìn)行濃度測(cè)定。將文庫(kù)稀釋至18?111〇1/^1^經(jīng)用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制備成乳液PCR樣本，Ion OneTouch? ES上進(jìn)行產(chǎn)物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上測(cè)序。
[0208] 11.數(shù)據(jù)分析
[0209] 首先過(guò)濾低質(zhì)量測(cè)序序列，去掉小于70bp的測(cè)序片段，將過(guò)濾后的序列比對(duì)到 148個(gè)用來(lái)設(shè)計(jì)引物的參考基因組序列片段，計(jì)算這148個(gè)目標(biāo)區(qū)域的總測(cè)序序列條數(shù)N和 各自的測(cè)序序列條數(shù)Ni。
[0210] 利用10個(gè)內(nèi)部參考區(qū)域的引物序列條數(shù)的均值N0,將138個(gè)AZF區(qū)域的引物序列 條數(shù)進(jìn)行均一化，公式為：Ci = Ni/N0。
[0211] 根據(jù)每個(gè)引物的Ci值，計(jì)算AZF區(qū)劃分的每個(gè)小區(qū)的均值，即得到待檢測(cè)樣本AZF 區(qū)各小區(qū)的真實(shí)拷貝數(shù)信息，例如g區(qū)有10個(gè)引物位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的Ci值分別為gl、g2、g3… gl〇,則g區(qū)拷貝數(shù)：
[0212] 通過(guò)待檢測(cè)樣本AZF區(qū)各小區(qū)的真實(shí)拷貝數(shù)信息與理論值的變化比較，發(fā)現(xiàn)AZFb 區(qū)內(nèi)b5、b6、ul等區(qū)及AZFc區(qū)內(nèi)b、g、r等區(qū)拷貝數(shù)均變?yōu)?，AZFa拷貝數(shù)不變（如圖6所 示）。檢測(cè)結(jié)論為該樣本Y染色體AZF區(qū)發(fā)生AZFb+c區(qū)缺失。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的引物組合物，其特征在于，引物位點(diǎn)包括至少6個(gè) Y染色體AZF區(qū)位點(diǎn)，以及至少一個(gè)Y染色體其他特異性區(qū)域的內(nèi)參位點(diǎn)。2. 權(quán)利要求1的引物組合物，其中，根據(jù)每個(gè)引物位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)上、中、下游三條引 物，每條引物長(zhǎng)l〇~50bp，優(yōu)選為20bp;每個(gè)引物位點(diǎn)的所述上、中、下游三條引物在參考基 因組序列上自5'到3'方向是連續(xù)的。3. 權(quán)利要求2的引物組合物，其中，所述引物的GC含量均為30%~70%，優(yōu)選50%。4. 權(quán)利要求2的引物組合物，其中，每個(gè)引物位點(diǎn)的所述中游和下游引物的5'端分別 進(jìn)行磷酸化修飾。5. 權(quán)利要求2的引物組合物，其中，每個(gè)引物位點(diǎn)的所述上游引物的5'端延伸15~30bp 的保護(hù)序列，優(yōu)選為20bp。6. 權(quán)利要求2的引物組合物，其中，每個(gè)引物位點(diǎn)的所述上游引物的5'端和下游引物 的3'端分別延伸通用擴(kuò)增引物序列。7. 權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的引物組合物，其中，所述參考基因組序列為hgl8或hgl9版 本。8. 權(quán)利要求1的引物組合物，其中，所述引物位點(diǎn)的序列與通用擴(kuò)增引物序列不存在 互補(bǔ)性。9. 權(quán)利要求1的引物組合物，其中，所述的AZF區(qū)引物位點(diǎn)覆蓋AZFa區(qū)，以及AZFbc區(qū) 的y、b、g、r、t、g亞區(qū)。10. 權(quán)利要求I的引物組合物，其中，所述的AZF區(qū)引物位點(diǎn)在該區(qū)域存在已知拷貝數(shù) 且在正常人AZF區(qū)域里拷貝數(shù)固定不變，AZF區(qū)域之外的基因組其他區(qū)域不存在該位點(diǎn)。11. 權(quán)利要求1的引物組合物，其中，所述的內(nèi)參位點(diǎn)選自SRY基因、ZFY基因和TBLlY 基因區(qū)域。12. 權(quán)利要求1的引物組合物，其中，所述的內(nèi)參位點(diǎn)僅在目標(biāo)區(qū)域唯一出現(xiàn)，在基因 組其他區(qū)域不存在該位點(diǎn)。13. 權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的引物組合物，所述引物位點(diǎn)的上、中、下游三條引物的序列 分別選自SEQIDNO:n、SEQIDNO: (n+148)、SEQIDNO: (n+296)，其中n為 1~148 的自 然數(shù)。14. 權(quán)利要求13的引物組合物，包括序列分別為SEQIDNO: 1-444的全部引物。15. 權(quán)利要求14的引物組合物，由序列分別為SEQIDNO: 1-444的引物組成。16. 權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的引物組合物在制備用于檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的診斷 試劑中的應(yīng)用。17. 權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的引物組合物在制備用于檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的試劑 盒中的應(yīng)用。18. 權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的引物組合物在體外非診斷目的檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失 中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)Y染色體AZF區(qū)微缺失的引物組合物。針對(duì)Y染色體AZF區(qū)域和其他作為內(nèi)部參考的特異性區(qū)域選定的引物位點(diǎn)設(shè)計(jì)了引物序列，這些引物序列的特點(diǎn)為：（1）每組引物均是以基因組上一段序列為模板來(lái)設(shè)計(jì)三條連續(xù)的引物，這三條引物連接后形成PCR模板；（2）在正常人染色體目標(biāo)區(qū)域，引物位點(diǎn)序列存在已知且不變的拷貝數(shù)，且在目標(biāo)區(qū)域之外的其他染色體區(qū)域不存在該序列；（3）這些序列引物具有接近的退火溫度，波動(dòng)范圍<5℃；（4）與通用擴(kuò)增引物序列不存在互補(bǔ)性；（5）內(nèi)參位點(diǎn)僅在目標(biāo)區(qū)域唯一出現(xiàn)，在基因組其他區(qū)域不存在該位點(diǎn)。還提供了所述引物組合物的用途。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105176992
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】費(fèi)嘉
【申請(qǐng)人】北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月19日