13000印1]1離心 8min，棄上清。共洗兩次。室溫晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0110] 4.雜交
[0111] 準(zhǔn)備Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室溫孵育）漩禍振蕩大于 30s徹底混勻，取10 μ L磁珠移到一個(gè)新的PCR管中，磁吸3min，棄上清5 μ L，備用。按照下 表混合反應(yīng)體系，輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡），PCR儀上95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰 置 IOmin0 CN 105176992 A 說(shuō)明書 13/21 頁(yè)
[0113] 冰置結(jié)束后，瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液加入準(zhǔn)備好的Myone Cl磁珠中，漩渦振蕩30s混 勻，避免有氣泡，室溫22~25°C (室溫不能低于20°C，最高不能超過(guò)27°C )輕輕旋轉(zhuǎn)混合 2h〇
[0114] 5.雜交產(chǎn)物的純化
[0115] 將PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液體澄清后棄上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 滌3次。加入45 μ L DNA溶解液重懸磁珠。
[0116] 6.連接
[0117] 將下表的連接體系置于PCR儀上，37°C反應(yīng)1小時(shí)。
[0119] 7.連接產(chǎn)物的純化
[0120] 將完成連接反應(yīng)的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液體澄清后棄上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管。共洗滌2次。 加入23 μ L DNA溶解液重懸磁珠，PCR儀上95°C變性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液移至新的PCR管中。
[0121] 8. PCR
[0122] 按照表格加反應(yīng)體系。
CN 105176992 A 說(shuō)明書 14/21 頁(yè)
[0125] 按照下述程序進(jìn)行反應(yīng)。
[0127] 9. PCR產(chǎn)物的純化
[0128] 將XP磁珠提前30min取出平衡至室溫，漩渦振蕩30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好標(biāo)記。取45 μ L PCR產(chǎn)物加入20 μ L XP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸3~5min，待液體徹底澄清后取上清62 μ L到97 μ L XP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸待液體澄清后棄上清，不取下離心管，加入75 %乙醇150 μ L，來(lái)回傾斜磁力架，使液體 沖洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin內(nèi)吸棄液體。共洗兩次。取下離心管瞬時(shí)離心， 再重新放置在磁力架上，至液體澄清時(shí)棄掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混勻 后室溫放置3~5min，磁吸后將上清（即文庫(kù)）轉(zhuǎn)移至新的EP管中。
[0129] 10.文庫(kù)測(cè)序
[0130] 取2以1^文庫(kù)用如1^丨2.0進(jìn)行濃度測(cè)定。將文庫(kù)稀釋至18?111〇1/^1^經(jīng)用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制備成乳液PCR樣本，Ion OneTouch? ES上進(jìn)行產(chǎn)物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上測(cè)序。
[0131] IL數(shù)據(jù)分析
[0132] 首先過(guò)濾低質(zhì)量測(cè)序序列，去掉小于70bp的測(cè)序片段，將過(guò)濾后的序列比對(duì)到 148個(gè)用來(lái)設(shè)計(jì)引物的參考基因組序列片段，計(jì)算這148個(gè)目標(biāo)區(qū)域的總測(cè)序序列條數(shù)N和 各自的測(cè)序序列條數(shù)Ni。
[0133] 利用10個(gè)內(nèi)部參考區(qū)域的引物序列條數(shù)的均值N0,將138個(gè)AZF區(qū)域的引物序列 條數(shù)進(jìn)行均一化，公式為：Ci = Ni/N0。
[0134] 根據(jù)每個(gè)引物的Ci值，計(jì)算AZF區(qū)劃分的每個(gè)小區(qū)的均值，即得到待檢測(cè)樣本AZF 區(qū)各小區(qū)的真實(shí)拷貝數(shù)信息，例如g區(qū)有10個(gè)引物位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的Ci值分別為gl、g2、g3… m γτΜ rrr-H/ rrtw. /n.齡懶:續(xù)+~相癒 glO,則g區(qū)拷貝數(shù)：G=-^-。
[0135] 通過(guò)待檢測(cè)樣本AZF區(qū)各小區(qū)的真實(shí)拷貝數(shù)信息與理論值的變化比較，發(fā)現(xiàn)AZFc 區(qū)內(nèi)g區(qū)拷貝數(shù)變?yōu)椹?而r區(qū)存在近1/4的拷貝數(shù)，判定b2/b3發(fā)生倒位；同時(shí)發(fā)現(xiàn)b區(qū) 拷貝數(shù)減少一半，AZFa和AZFb區(qū)拷貝數(shù)不變（如圖4所示）檢測(cè)結(jié)論為該樣本Y染色體 AZF區(qū)發(fā)生b2/b3倒位后gl/b4區(qū)缺失。
[0136] 實(shí)施例3外周血樣本檢測(cè)AZF區(qū)微缺失
[0137] 一、材料：
[0138] 1.標(biāo)本：樣本來(lái)源為合作醫(yī)院接診的一位男性少精癥患者的外周血樣本，經(jīng)醫(yī)院 采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)為Y染色體AZF區(qū)正常。
[0139] 2.試劑：血漿DNA提取試劑盒、Qubi丨S. dsDNA HS分析試劑盒、生物素、標(biāo)記 酶、標(biāo)記酶反應(yīng)液、超純水、雜交緩沖液、雜交引物、DNA溶解液（Low TE)、連接酶、連 接酶反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、標(biāo)簽接頭、洗滌液、XP磁珠、異丙醇、無(wú)水乙醇、Dyrmkxuis?' MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease-free Water (not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0140] 3.器材：高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋、磁力架、PCR儀、Ion OneTouch? 2Instrument、 Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM 測(cè)序儀、Ion 316? Chip v2、四維旋轉(zhuǎn)混合儀、迷你離 心機(jī)、漩渦振蕩器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0141] 二、操作步驟：
[0142] 1.用血漿DNA提取試劑盒提取血漿DNA。
[0143] 2. DNA 標(biāo)記
[0144] 按照下表制備反應(yīng)體系，混勻后37°C溫浴1小時(shí)。
[0146] 3.標(biāo)記產(chǎn)物的純化
[0147] 加等體積異丙醇（預(yù)冷_20°C )，-70°C放置1小時(shí)以上或-20°C放置過(guò)夜， 4°〇13000印111離心40111；[11。用300 4 1^新鮮配制的75%乙醇洗滌沉淀，4°0 13000印1]1離心 8min，棄上清。共洗兩次。室溫晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0148] 4.雜交
[0149] 準(zhǔn)備Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室溫孵育）漩禍振蕩大于 30s徹底混勻，取10 μ L磁珠移到一個(gè)新的PCR管中，磁吸3min，棄上清5 μ L，備用。按照下 表混合反應(yīng)體系，輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡），PCR儀上95°C反應(yīng)5min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰 置 IOmin0
[0150] CN 105176992 A 說(shuō)明書 16/21 頁(yè)
[0151] 冰置結(jié)束后，瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液加入準(zhǔn)備好的Myone Cl磁珠中，漩渦振蕩30s混 勻，避免有氣泡，室溫22~25°C (室溫不能低于20°C，最高不能超過(guò)27°C )輕輕旋轉(zhuǎn)混合 2h〇
[0152] 5.雜交產(chǎn)物的純化
[0153] 將PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液體澄清后棄上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 滌3次。加入45 μ L DNA溶解液重懸磁珠。
[0154] 6.連接
[0155] 將下表的連接體系置于PCR儀上，37°C反應(yīng)1小時(shí)。
[0157] 7.連接產(chǎn)物的純化
[0158] 將完成連接反應(yīng)的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液體澄清后棄上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗滌液，吹吸混勻，磁吸后棄上清，取下離心管。共洗滌2次。 加入23 μ L DNA溶解液重懸磁珠，PCR儀上95°C變性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液移至新的PCR管中。
[0159] 8. PCR
[0160] 按照表格加反應(yīng)體系。
CN 105176992 A 說(shuō)明書 17/21 頁(yè)
[0163] 按照下述程序進(jìn)行反應(yīng)。
[0165] 9. PCR產(chǎn)物的純化
[0166] 將XP磁珠提前30min取出平衡至室溫，漩渦振蕩30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好標(biāo)記。取45 μ L PCR產(chǎn)物加入20 μ L XP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸3~5min，待液體徹底澄清后取上清62 μ L到97 μ L XP磁珠中，混勻后室溫放置5min。 磁吸待液體澄清后棄上清，不取下離心管，加入75 %乙醇150 μ L，來(lái)回傾斜磁力架，使液體 沖洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin內(nèi)吸棄液體。共洗兩次。取下離心管瞬時(shí)離心， 再重新放置在磁力架上，至液體澄清時(shí)棄掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混勻 后室溫放置3~5min，磁吸后將上清（即文庫(kù)）轉(zhuǎn)移至新的EP管中。
[0167] 10.文庫(kù)測(cè)序
[0168] 取2以1^文庫(kù)用〇1*^2.0進(jìn)行濃度測(cè)定。將文庫(kù)稀釋至18?111〇1/^1^經(jīng)用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制備成乳液PCR樣本，Ion OneTouch? ES上進(jìn)行產(chǎn)物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上測(cè)序。
[0169] 11.數(shù)據(jù)分析
[0170] 首先過(guò)濾低質(zhì)量測(cè)序序列，去掉小于70bp的測(cè)序片段，將過(guò)濾后的序列比對(duì)到 148個(gè)用來(lái)設(shè)計(jì)引物的參考基因組序列片段，計(jì)算這148個(gè)目標(biāo)區(qū)域的總測(cè)序序列條數(shù)N和 各自的測(cè)序序列條數(shù)Ni。
[0171] 利用10個(gè)內(nèi)部參考區(qū)域的引物序列條數(shù)的均值N0,將138個(gè)AZF區(qū)域的引物序列 條數(shù)進(jìn)行均一化，公式為：Ci = Ni/N0。
[0172] 根據(jù)每個(gè)引物的Ci值，計(jì)算AZF區(qū)劃分的每個(gè)小區(qū)的均值，即得到待檢測(cè)樣本AZF 區(qū)各小區(qū)的真實(shí)拷貝數(shù)信息，例如g區(qū)有10個(gè)引物位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的Ci值分別為gl、g2、g3… gl〇,則 g 區(qū)拷貝數(shù)：
[0173] 通過(guò)待檢測(cè)樣本AZF區(qū)各小區(qū)的真實(shí)拷貝數(shù)信息與理論值的變化比較，發(fā)現(xiàn) AZFa