人ApoE-ε4抗原表位肽、抗原、抗體、應(yīng)用及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明屬于多膚化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人載脂蛋白Ε- ε 4(ΑροΕ- ε 4)抗原 表位膚、用該抗原表位膚制備的ApoE- ε 4特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體、 所述抗體在制備人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒上的應(yīng)用，人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒，W及 一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人ApoE- ε 4蛋白的英光免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 老年性癡呆（Alzheimer's disease, AD)是一種原發(fā)性大腦退行性疾病，已經(jīng)成為 人類(lèi)繼必血管病、癌癥、中風(fēng)之后的第四大殺手。按目前的醫(yī)療水平，對(duì)于AD的治療，只能 延緩早期患者的病情發(fā)展，對(duì)中晚期的患者尚無(wú)有效的治療方法。因此，早期診斷、早期干 預(yù)、延緩病情發(fā)展成為AD治療的關(guān)鍵。近年來(lái)，對(duì)老年性癡呆早期診斷的研究已經(jīng)引起許 多研究者的注意，尋找一種有效的、可靠的、非侵入式的、生化檢測(cè)手段是眾多研究者的共 同必愿。ApoE-ε 4就是送樣的一種生化標(biāo)志物。
[000引 ApoE是研究較多的基因，也是影響老化途徑的最重要的遺傳因素之一，ApoE- ε 4 基因攜帶者是公認(rèn)的ad致病因素。研究發(fā)現(xiàn)，19號(hào)染色體上的載脂蛋白Ε(Αρο巧基因的 ε 4等位基因是AD的準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)因子，且二者之間存在著劑量依賴效應(yīng)。因此，通過(guò)在血清中 檢測(cè)載脂蛋白Ε，可W判斷AD。因此，ApoE- ε 4有希望作為AD診斷的標(biāo)志物。
[0004] 檢測(cè)血清中的ApoE水平的最理想的方法為免疫檢測(cè)。因此，尋找合適的具有免疫 原性的ApoE抗原表位膚、制備特異性的ApoE抗原及抗體即成了重點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種人ApoE- ε 4抗原表位 膚，用該抗原表位膚制備的ApoE- ε 4特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體，其在 帶I備人ApoE- ε 4試劑盒上的應(yīng)化W及人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒。
[0006] 具體而言，本發(fā)明提供了：
[0007] -種人ApoE- ε 4抗原表位膚，其中所述ApoE- ε 4抗原表位膚的氨基酸序列為如 下兩者之一：
[0008] (1)Tyr-Lys-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-T虹-Glu-Pro-Glu-Pro-Glu-Leu-Arg ;
[0009] (2)Tyr-Ser-Arg-T虹-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Glu-Val-Lys-Glu-Gln-Val-Ala-Gl u-Va1-Arg-Ala-Lys。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種ApoE- ε 4抗原，其是通過(guò)使所述的人ApoE- ε 4抗原表位膚 (1) 與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種ApoE- ε 4抗原，其是通過(guò)使所述的人ApoE- ε 4抗原表位膚 (2) 與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種人ApoE- ε 4抗體，其是由所述的ApoE- ε 4抗原制備而成的 單克隆抗體或多克隆抗體，其中所述ApoE- ε 4抗原是通過(guò)使所述的人ApoE- ε 4抗原表位 膚（1)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種人ApoE- ε 4抗體，其是由所述的ApoE- ε 4抗原制備而成的 單克隆抗體或多克隆抗體，其中所述ApoE- ε 4抗原是通過(guò)使所述的人ApoE- ε 4抗原表位 膚（2)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述的人ApoE- ε 4抗體在制備人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒上的 應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒，其包含所述的人ApoE- ε 4抗 體作為包被抗體，其中所述包被抗體優(yōu)選為單克隆抗體。
[0016] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包含結(jié)合抗體，所述結(jié)合抗體為所述的人ApoE- ε 4抗體， 并且該結(jié)合抗體優(yōu)選為多克隆抗體，并且當(dāng)所述結(jié)合抗體來(lái)源于所述的人ApoE- ε 4抗原 表位膚（1)和（2)中的一者時(shí)，所述包被抗體來(lái)源于所述的人ApoE- ε 4抗原表位膚（1)和 (2)中的另一者。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包含酶標(biāo)記的第二抗體。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0019] 1.本發(fā)明的人ApoE- ε 4抗原表位膚具有良好的抗原性，用其制備的抗原（免疫 原）免疫動(dòng)物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。
[0020] 2.用本發(fā)明制備的ApoE- ε 4單克隆抗體和多克隆抗體能夠高度特異地與血液樣 本中的ApoE- ε 4結(jié)合。
[0021] 3.本發(fā)明的人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒可W有效地檢測(cè)血清中的ApoE- ε 4的水 平，可用來(lái)判斷老年性癡呆。
[0022] 4.本發(fā)明將英光分析技術(shù)與快速層析免疫技術(shù)相結(jié)合，提供了一種用于定量檢 測(cè)待測(cè)物中人ApoE- ε 4蛋白的英光免疫層析試紙，用該試紙檢測(cè)待測(cè)物中的人ApoE- ε 4 蛋白，操作簡(jiǎn)便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測(cè)，并且檢測(cè)范圍寬、特異性高、靈敏度 好，能夠迅速及時(shí)地幫助診斷病情，監(jiān)測(cè)預(yù)后。
[0023] 5.本發(fā)明在制備所述人ApoE-ε 4蛋白的英光免疫層析試紙的過(guò)程中，通過(guò)大量 的試驗(yàn)摸索，優(yōu)化了各方面的制備條件，使得用本發(fā)明的英光免疫層析試紙進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，英 光信背比大大提高，從而提高了檢測(cè)靈敏度和結(jié)果可信度；此外，本發(fā)明還通過(guò)試紙的檢測(cè) 區(qū)與質(zhì)控區(qū)的英光強(qiáng)度比值的變化來(lái)反應(yīng)樣品中ApoE- ε 4的含量，送與傳統(tǒng)的層析技術(shù) 只考查檢測(cè)區(qū)的絕對(duì)英光強(qiáng)度相比，最大程度上減少了外界條件和背景等的影響，進(jìn)一步 提高了檢測(cè)結(jié)果可信度。
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下通過(guò)【具體實(shí)施方式】的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但送并非是對(duì)本發(fā)明的限 巧||，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可W做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本 發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[00巧]一、人ApoE- ε 4抗原表位膚
[0026] 本文中所述的人ApoE- ε 4蛋白是本領(lǐng)域已知的，其氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的， 可W在NCBI等專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中查到。
[0027] 本發(fā)明提供了人ApoE- ε 4抗原表位膚（1)和似，其氨基酸序列分別如序列表SEQ ID No. 1和沈Q ID No. 2所示，為：
[0028] (1) Y-K-V-E-Q-A-V-E-T-E-P-E-P-EA-R ;和
[0029] (2) Y-S-R-T-R-D-RA-D-E-V-K-E-Q-V-A-E-V-R-A-K。
[0030] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的理論研究和實(shí)驗(yàn)摸索，最終篩選得到兩種具有良好的 抗原性的抗原表位膚。
[0031] ApoE- ε 4抗原表位膚（1)包含人ApoE- ε 4蛋白（NCBI登錄號(hào)AAB59546. 1)N端第 19位至第33位膚段，并且在該膚段的N段加上一個(gè)Y，從而構(gòu)成ApoE- ε 4抗原表位膚（1)。
[0032] ApoE- ε 4抗原表位膚（2)包含人ApoE- ε 4蛋白（NCBI登錄號(hào)ΑΑΒ59546. 1) C端第 241位至第260位的膚段，并且在該膚段的Ν段加上一個(gè)Υ，從而構(gòu)成ApoE- ε 4抗原表位膚 似。
[0033] 送兩個(gè)膚段均具有親水性、抗原性強(qiáng)并且易于合成的特點(diǎn)。
[0034] 目前，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的ApoE- ε 4抗原表位膚具有如下功能：
[0035] 1.具有抗原性；2.與載體蛋白連接后作為免疫原刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體； 3.用抗原表位膚制備的抗體可特異性地與人ApoE- ε 4結(jié)合。
[0036] 本發(fā)明的ApoE- ε 4抗原表位膚的制備方法可用化學(xué)合成法；利用美國(guó)ΑΒΙ431Α型 多膚自動(dòng)合成儀，通過(guò)固相法合成抗原表位膚。本發(fā)明的抗原表位膚（1)和（2)的分子量 分別為2187. 32、2909. 12,可用質(zhì)譜進(jìn)行確定，并通過(guò)多膚序列測(cè)定鑒定所合成的抗原表位 膚序列。膚段的純度可用薄層色譜和高效液相色譜進(jìn)行評(píng)定，并測(cè)定抗原表位膚的濃度。
[0037] 二、ApoE-ε 4 抗原
[0038] 本發(fā)明還提供了 ApoE- ε 4抗原，其通過(guò)使本發(fā)明的人ApoE- ε 4抗原表位膚（1) 和（2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。具體而言，本發(fā)明提供了 ApoE-ε 4抗原（1)和 (2)，所述ΑροΕ-ε4抗原（1)通過(guò)使本發(fā)明的人ΑροΕ-ε4抗原表位膚（1)與載體蛋白偶聯(lián) 制備而成；所述ApoE- ε 4抗原（2)通過(guò)使本發(fā)明的人ApoE- ε 4抗原表位膚（2)與載體蛋白 偶聯(lián)制備而成。本發(fā)明的ApoE- ε 4抗原具有免疫原性和特異性，是一種免疫原，可用來(lái)免 疫動(dòng)物從而制備特異性的ApoE- ε 4抗體。在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH (鑰 孔血藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白度SA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性 強(qiáng)，結(jié)合位點(diǎn)多，免疫效果較好，并且與免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引 起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[003引 S、ApoE- ε 4單克隆抗體、ApoE- ε 4多克隆抗體和人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒
[0040] 本發(fā)明還提供了人ApoE- ε 4單克隆抗體和人ApoE- ε 4多克隆抗體，所述抗體可 W各自利用本發(fā)明的ApoE-ε 4抗原（1)或（2)(免疫原）免疫動(dòng)物制備而得。制備方法可 采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，具體可參見(jiàn)實(shí)施例2。
[00川本發(fā)明的ApoE- ε 4單克隆抗體和多克隆抗體可W用于制備人ApoE- ε 4體外診斷 試劑盒，該試劑盒可W基于免疫方法對(duì)人體組織、細(xì)胞或體液中的ApoE-ε 4進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu) 選對(duì)血液標(biāo)本中的ApoE- ε 4進(jìn)行檢測(cè)。
[0042] 因此，本發(fā)明提供了 一種人ApoE-ε 4體外診斷試劑盒，其包含本發(fā)明的人 ApoE- ε 4單克隆抗體或多克隆抗體。
[0043] 目前已知可用于臨床檢驗(yàn)的免疫實(shí)驗(yàn)方法主要包括W下幾種；ELISA法、化學(xué)發(fā) 光法、英光