層析法、膠體金免疫測定法等。
[0044] 而化ISA法包括W下幾種類型；雙抗體夾必法檢測抗原、雙抗原夾必法檢測抗體、 間接法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、捕獲包被法測抗體等。
[0045] 本發(fā)明的人ApoE-ε 4體外診斷試劑盒優(yōu)選采用ELISA雙抗體夾必法來檢測 ApoE- ε 4蛋白。該試劑盒可W包含包被抗體、結(jié)合抗體、酶標(biāo)記的第二抗體和/或必要的工 具和試劑等。
[0046] 優(yōu)選的是，所述人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒采用本發(fā)明的人ApoE- ε 4單克隆抗 體作為包被抗體。在此，術(shù)語"包被抗體"是指包被于固相的酶標(biāo)板上的抗體。此外，所述 人ApoE- ε 4體外診斷試劑盒還優(yōu)選包含人ApoE- ε 4多克隆抗體W作為結(jié)合抗體，其中，當(dāng) 所述結(jié)合抗體來源于本發(fā)明的人ΑροΕ-ε4抗原表位膚（1)和（2)中的一者時，所述包被 抗體來源于所述抗原表位膚（1)和（2)中的另一者。在此，術(shù)語"結(jié)合抗體"是指試劑盒中 可與待測抗原及酶標(biāo)記第二抗體結(jié)合的特異性抗體。所述試劑盒還可W包含酶標(biāo)記的第二 抗體，該第二抗體可W為羊抗兔IgG抗體，所述酶標(biāo)記可W為辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶 等。
[0047] 在本發(fā)明的試劑盒中，還可W包含檢測所需的任何試劑或工具，例如預(yù)包被板、洗 涂液、顯色劑、終止液等。
[004引四、用于定量檢測人ApoE- ε 4蛋白的英光免疫層析試紙
[0049] 本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測待測物中人ApoE- ε 4蛋白的英光免疫層析試 紙，該試紙通過雙抗體夾必法檢測所述人ApoE- ε 4蛋白，其中：
[0050] 所述雙抗體夾必法采用標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單克隆抗體作為捕獲抗 體，所述第一 ApoE- ε 4單克隆抗體來源于人ApoE- ε 4抗原表位膚（1)和（2)中的一者；并 且
[0051] 所述雙抗體夾必法還采用第二ApoE- ε 4單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二 ApoE-ε 4單克隆抗體來源于人ApoE-ε 4抗原表位膚（1)和（2)中的另一者；
[005引所述人ApoE- ε 4抗原表位膚（1)和似分別為：
[0053] (1)Tyr-Lys-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-T虹-Glu-Pro-Glu-Pro-Glu-Leu-Arg ;
[0054] (2)Tyr-Ser-Arg-T虹-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Glu-Val-Lys-Glu-Gln-Val-Ala-Gl u-Va1-Arg-A1a-Ly s。
[0055] 在本發(fā)明中，在雙抗體夾必法英光免疫層析試紙中，"捕獲抗體"是指能夠首先特 異性識別待測抗原的抗體，其通常設(shè)置在結(jié)合墊上；"檢測抗體"是指另一種能夠特異性識 別待測抗原的抗體，其與捕獲抗體分別識別待測抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反應(yīng)膜的檢測區(qū)上。
[0056] 在本發(fā)明中，所述第一 ApoE- ε 4單克隆抗體可W由第一 ApoE- ε 4抗原制備而成， 該第一 ApoE- ε 4抗原可W通過使所述人ApoE- ε 4抗原表位膚（1)和（2)中的一者與載體 蛋白偶聯(lián)制備而成；并且所述第二ApoE- ε 4單克隆抗體可W由第二ApoE- ε 4抗原制備而 成，該第二ApoE-ε 4抗原可W通過使所述人ApoE-ε 4抗原表位膚（1)和（2)中的另一者 與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。
[0057] 在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白）、牛血清白蛋白 度SA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白）免疫原性強(qiáng)，結(jié)合位點(diǎn)多，免疫效果較 好，并且與免疫動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。
[005引優(yōu)選地，本發(fā)明的英光免疫層析試紙中所用的英光微球的粒徑為320nm至400nm， 優(yōu)選為360nm，英光微球上的英光物質(zhì)可為異硫氯酸英光素、四己基羅丹明、四甲基異硫氯 酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明（可購自上海晶純公司）。英光微球的微球 材料可W為聚苯己帰、聚甲基丙帰酸甲醋或由甲基丙帰酸甲醋與其它單體共聚形成的共聚 物，其它單體的例子為苯己帰等。英光微球的激發(fā)波長可W為350~600nm，優(yōu)選為390nm ; 發(fā)射波長可W為500~700皿，優(yōu)選為615皿。
[0059] 在本發(fā)明中，英光微球的最大激發(fā)波長與發(fā)射波長差值較大，說明英光微球有較 大的斯巧克斯（Stokes)位移，送樣，英光試紙的背景干擾較低，W該微球做免疫層析標(biāo)記 物有較強(qiáng)的優(yōu)勢。
[0060] 在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的英光免疫層析試紙具有底板，并且在該底 板上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙， 所述樣品墊用于在使用時加載待測樣品，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記有英光微球的第 一 ApoE-ε 4單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)包被有所述第二 ApoE- ε 4單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單 克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。
[0061] 優(yōu)選地，本發(fā)明的英光免疫層析試紙的樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙可W沿 使用時的層析方向依次搭接設(shè)置在底板上。反應(yīng)膜上間隔設(shè)置的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)可W為， 但不限于，線、帶、塊等形式，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)優(yōu)選間隔3mm至8mm。
[0062] 在本發(fā)明中，反應(yīng)膜優(yōu)選為在大于550nm的波長下基本上不發(fā)英光的硝酸纖維素 膜（例如可購自上海杰一，型號GFCP203000)。在本文中，"基本上不發(fā)英光"的含義是指在 相應(yīng)波長（例如大于550nm的波長）的光照下不發(fā)射英光，或者僅發(fā)射微量的、不實(shí)質(zhì)上影 響檢測結(jié)果的英光。此外，底板優(yōu)選基本上不具有英光性質(zhì)，例如為基本上不具有英光性質(zhì) 的PVC背板（例如可購自上海杰一，型號HF000MC100)。在本文中，"基本上不具有英光性 質(zhì)"是指不具有英光性質(zhì)，或者僅具有低的、不實(shí)質(zhì)上影響檢測結(jié)果的英光性質(zhì)。
[0063] 通常，常規(guī)的層析試紙組件（反應(yīng)膜、底板等）在550nm波長下具有較明顯的英光 背景，送對英光信號的檢測產(chǎn)生很大干擾。本發(fā)明通過采用在大于550nm的波長下基本上 不發(fā)英光的硝酸纖維素膜和低英光性質(zhì)的底板，從而克服了常規(guī)英光試紙的缺陷。此外，本 發(fā)明所用的英光物質(zhì)X-羅丹明可產(chǎn)生較強(qiáng)的英光信號，從而進(jìn)一步大大提高了英光信背 比，使得能夠很好地區(qū)分信號和背景，進(jìn)而提高檢測靈敏度。
[0064] 在本發(fā)明中，樣品墊和結(jié)合墊的材料可采用本領(lǐng)域通常使用的材料，例如，樣品墊 和結(jié)合墊可W為玻璃纖維。
[0065] 本發(fā)明所采用的能與標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單克隆抗體特異性結(jié)合的 抗抗體可W為羊抗鼠 IgG單克隆抗體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠 IgG單 克隆抗體，與多克隆抗體相比，單克隆抗體特異性更高。
[0066] 在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的英光免疫層析試紙?jiān)谑褂脮r，在樣品墊上滴 加樣品液（如含有ApoE- ε 4的血樣），在毛細(xì)管作用下，樣品液向吸水濾紙一端移動，在結(jié) 合墊處與所述的標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單克隆抗體形成免疫復(fù)合物，該免疫復(fù) 合物進(jìn)一步移動，在檢測線上與所述第二ApoE- ε 4單克隆抗體結(jié)合形成雙抗體夾必的免 疫復(fù)合物，而未形成免疫復(fù)合物的標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單克隆抗體則與質(zhì)控 線上的抗抗體結(jié)合。此過程需要10分鐘至15分鐘，之后，用英光檢測儀進(jìn)行檢測，如果質(zhì) 控線處未出現(xiàn)條帶，則說明試紙失效；如果質(zhì)控線處出現(xiàn)條帶，而檢測線處未出現(xiàn)條帶，貝U 說明樣品中不含人ApoE- ε 4蛋白；如果在質(zhì)控線和檢測線上均出現(xiàn)條帶，則說明樣品中含 有人ΑροΕ-ε4蛋白。
[0067] 在另一個方面，本發(fā)明提供了 一種制備用于定量檢測待測物中人ApoE- ε 4蛋白 的英光免疫層析試紙的方法，其包括W下步驟：
[006引 1)提供標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單克隆抗體；
[0069] 。提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單克隆抗體；
[0070] 扣提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二 ApoE- ε 4單克隆抗體和抗抗體，W分別形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；
[0071] 4)在底板上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述 反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述英光免疫層析試紙。
[0072] 本發(fā)明的方法還可W包括將制成的英光免疫層析試紙切割成適當(dāng)寬度的步驟5)。
[0073] 本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的試驗(yàn)摸索，優(yōu)化了制備本發(fā)明的用于檢測人ApoE- ε 4 蛋白的英光免疫層析試紙的方法的各個步驟的條件，從而使得本發(fā)明的英光免疫層析試紙 能夠針對人ApoE- ε 4蛋白獲得符合臨床檢測要求的結(jié)果，即，檢測范圍寬、特異性高、靈敏 度好。
[0074] 因此，優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，所述步驟1)包括：
[0075] a)用碳二亞胺活化英光微球，優(yōu)選地，將英光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述英光微球；
[0076] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的英光 微球用N-居基硫代玻巧醜亞胺-巧樣酸緩沖液洗涂、分散，并經(jīng)超聲波處理；
[0077] C)用步驟b)所獲得的英光微球標(biāo)記第一 ApoE- ε 4單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟 b)所獲得的英光微球與第一 ApoE- ε 4單克隆抗體混合，用BSA-己醇胺緩沖液封閉，離必， 用BSA-吐溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有英光微球的第一 ApoE- ε 4單克隆 抗體。
[0078] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，所述步驟1)包括：
[0079] a)取1 (w/v) %的英光微球水分散液，10000巧m至1500化pm低溫（例如1(TC )離 必5至10分鐘，去上清，將沉淀物分散到500 μ 1的蒸傭水或初洗緩沖液化1M的MES水溶 液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重復(fù)W上過程立次，加入碳二亞胺lOmg至50mg，攬 拌10~15分鐘，從而活化所述英光微球；
[0080] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，優(yōu)選