r>[0169] TFA( Η氣己酸，可購(gòu)自sigma公司）
[0170] 己酸己醋，可購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0171] 氯了焼，可購(gòu)自sigma公司
[0172] 己臘，可購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0173] (4)測(cè)定
[0174] 按儀器說明書進(jìn)行。
[017引結(jié)果；經(jīng)鑒定，所得ApoE- ε 4抗原表位膚（1)和似的序列分別為：
[0176] (1) Y-K-V-E-Q-A-V-E-T-E-P-E-P-EA-R ;和
[0177] (2)Y-S-R-T-R-D-R-L-D-E-V-K-E-Q-V-A-E-V-R-A-K。
[0178] 該結(jié)果與目標(biāo)合成膚段一致。
[017引實(shí)施例2 ;分別將實(shí)施例1所得的ApoE- ε 4抗原表位膚（1)和似與載體蛋白連 接W制備ApoE-ε 4抗原（1)和（2)，利用所得抗原（1)和（2)分別免疫動(dòng)物，從而利用抗 原（1)制備特異性的單克隆抗體和多克隆抗體，并且利用抗原（2)制備特異性的單克隆抗 體和多克隆抗體。
[0180] 1.抗原的制備；用抓B(Bis-diazotizedbenzidine dichloride)法將ApoE-ε 4膚 段（1)和（2)分別與載體蛋白KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白）（得自sigma公司）連接制備成ApoE- ε 4 抗原（1)和似。
[01引]取ApoE- ε 4膚段（1)或似10.0 mg，用1ml 0. 1Μ PBS緩沖液加7. 4)溶解； KLH lOmg，用0. 2M測(cè)酸鹽緩沖液（pH9. 0)20ml溶解；然后將兩者混合，冷卻至0°C，取 BDBClzllOu L，室溫下反應(yīng)1.化，透析過夜后分裝，-2(TC保存。
[0182] 在本實(shí)施例中，PBS緩沖液的配方為；0. 2mol/L的Na2HP〇481ml加 0. 2mol/L的 NaH2P〇4l9ml混合而成。
[0183] 測(cè)酸鹽緩沖液的配方為；0. 05mol/L測(cè)砂80ml，加 0. 2mol/L測(cè)酸20ml混合而成。
[0184] 2.免疫動(dòng)物制備單克隆抗體：
[0185] 2. 1.取上述制備的ApoE- ε 4抗原（1)和（2)(免疫原）分別與等體積的弗氏完全 佐劑（購(gòu)自上海源聚生物公司）充分混合后，免疫Ba化/c小鼠，50 μ g抗原/只，皮下多點(diǎn) 注射。4周后測(cè)血清效價(jià)，選擇免疫反應(yīng)性好的小鼠再加強(qiáng)免疫；取抗原與等體積的不完全 弗氏佐劑（購(gòu)自上海源聚生物公司）充分混合后，抗原劑量25 μ g/只，皮下多點(diǎn)注射，加強(qiáng) 免疫的次數(shù)為6次，每次間隔2-3周，融合前另外連續(xù)加強(qiáng)免疫兩次，每次間隔1-2周，之后 取脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50% PEG(MW4000)(購(gòu)自中原化工公司）介導(dǎo) 進(jìn)行融合，并用HAT條件培養(yǎng)基（購(gòu)自sigma公司）選擇培養(yǎng)。融合后放入C〇2培養(yǎng)箱中 37°C培養(yǎng)9~11天后，孔內(nèi)出現(xiàn)較大的細(xì)胞克隆。11天開始用間接化ISA進(jìn)行篩選。對(duì)初 篩陽性的孔利用有限稀釋法進(jìn)行4次克隆化培養(yǎng)（即使篩選后的細(xì)胞大量分裂繁殖），之后 擴(kuò)增細(xì)胞、凍存、制備腹水。
[0186] 2. 2.將Ba化/c小鼠用降植焼（購(gòu)自sigma公司）0. 5ml/只處理，一周后腹腔接種 雜交瘤細(xì)胞2X 1〇6個(gè)/只，10天后收集腹水。
[0187] 2. 3.測(cè)定抗體效價(jià)：用間接化ISA方法測(cè)定利用ApoE- ε 4抗原（1)制備的單克 隆抗體（1)的效價(jià)，結(jié)果顯示單抗的效價(jià)達(dá)到1:32000 W上。
[0188] 利用ApoE- ε 4抗原（2)制備的單克隆抗體（2)的效價(jià)也利用相同的方法進(jìn)行測(cè) 定，其效價(jià)也達(dá)到1:32000 W上。
[0189] 3.免疫動(dòng)物制備多克隆抗體：
[0190] 3. 1.選用Η個(gè)月齡、體重約為2kg左右的新西蘭白兔作為免疫動(dòng)物?；A(chǔ)免疫 中，將l-2mg上述制備的ApoE- ε 4抗原（1)和似（免疫原）分別與等體積的完全弗氏佐 劑（購(gòu)自上海源聚生物公司）混合-充分乳化后在兔子背部進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射。每隔4周 加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫6次，抗原與不完全弗氏佐劑（購(gòu)自上海源聚生物公司）充分乳化 后，W 100 μ g/只于背部多點(diǎn)皮下注射。末次加強(qiáng)免疫后第10天頸動(dòng)脈放血，分離血清。 [01川 3. 2.測(cè)定抗體效價(jià)；用間接ELISA法測(cè)定利用ApoE- ε 4抗原（1)制備的多克隆 抗體（1)的效價(jià)，結(jié)果顯示抗體效價(jià)達(dá)到1:32000 W上。
[0192] 利用ApoE- ε 4抗原（2)制備的多克隆抗體（2)的效價(jià)也利用相同的方法進(jìn)行測(cè) 定，其效價(jià)也達(dá)到1:32000 W上。
[0193] 3. 3.取血及分離血清：頸動(dòng)脈插管取血，分離血清。
[0194] 4.分離純化抗體；硫酸倭沉淀后，再經(jīng)Protein G(購(gòu)自sigma公司）親和純化。
[0195] 5.抗體分裝后凍干，低溫保存。
[019引實(shí)施例3 ;人ApoE- ε 4單克隆抗體（1)和似的特異性鑒定 [0197] W化ISA進(jìn)行檢測(cè)。分別W人ApoE- ε 4蛋白、S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性帰醇化 酶NSE (均購(gòu)自上海聯(lián)碩公司）為檢測(cè)抗原包被化ISA板，通過化ISA分別檢測(cè)所制備的 ApoE- ε 4單克隆抗體（1)和（2)與該人ApoE- ε 4蛋白的特異性反應(yīng)，W正常BALB/c小鼠 血清作陰性對(duì)照，PBS液作空白對(duì)照。
[019引結(jié)果；ApoE- ε 4單克隆抗體（1)和似分別只與ApoE- ε 4反應(yīng)為陽性（P/N〉2. 1)， 而與S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性帰醇化酶NSE反應(yīng)為陰性，說明本發(fā)明的ApoE- ε 4單克隆 抗體（1)和（2)分別具有特異性。
[019引實(shí)施例4 ;人ApoE- ε 4多克隆抗體（1)和似的特異性鑒定 [0200] 利用與上述鑒定單克隆抗體特異性相同的方法進(jìn)行鑒定。
[020。 結(jié)果顯示；ApoE- ε 4多克隆抗體（1)和似分別與ApoE- ε 4反應(yīng)為陽性（Ρ/ Ν〉2. 1)，而與S-100B蛋白、神經(jīng)元特異性帰醇化酶NSE反應(yīng)為陰性，說明本發(fā)明的ApoE- ε 4 多克隆抗體（1)和（2)分別具有特異性。
[020引實(shí)施例5 ;利用ApoE- ε 4單克隆抗體和ApoE- ε 4多克隆抗體制備ApoE- ε 4體外 診斷試劑盒。
[0203] 在本實(shí)施例中，將實(shí)施例2中利用ApoE- ε 4抗原表位膚（1)制備的單克隆抗體 (1)作為本試劑盒中的包被抗體；將實(shí)施例2中利用ApoE- ε 4抗原表位膚（2)制備的多克 隆抗體（2)作為結(jié)合抗體。
[0204] ApoE- ε 4體外診斷試劑盒的制備和操作如下：
[0205] 1.各種緩沖液及試劑的配制：
[0206] Α、包被緩沖液；0. 050Μ、ρΗ9. 6的CB (碳酸鹽緩沖液）
[0207] 胞2〇)3;16. 0 克
[020引 Na肥03 ;29. 0 克
[0209] 蒸傭水溶至1000ml
[0210] B、樣品 / 洗涂緩沖液；pH7. 2 的 lOXPBS-Tween 20
[0211] 胞2冊(cè)〇4 · 12&0 ;58 克 [0引引 皿2口04;4克
[0引引 化ciaoo克
[0214] KC1;4 克
[0215] 蒸傭水溶至1000ml
[021 引 加 Tween 20 ;20ml [0217] C、酶標(biāo)記物稀釋液：
[021 引 lOXPBS-Tween 20 ;10ml
[0219] FCS (小牛血清）；20ml
[0220] 蒸傭水溶至1000ml
[0221] 酶穩(wěn)定劑（可購(gòu)自上海西寶公司）；1克
[0222] 生物防腐劑（可購(gòu)自上海西寶公司）；1ml
[0223] D、顯色劑 A:
[0224] 巧樣酸；35. 5克
[0225] 過氧化脈；10克
[0226] 蒸傭水溶至1000ml
[0227] Tween 20; 10ml
[022引 6、顯色劑6:
[0229] 巧樣酸；120克
[0230] 邸TA-2化；1 克
[023U TMB.2肥1:2 克
[0232] 蒸傭水溶至1000ml
[0233] F、終止液；2M H2SO4
[0234] 濃硫酸巧5-98%);22.21111
[0235] 蒸傭水：177. 3ml
[0236] 配時(shí)將濃硫酸緩慢滴入蒸傭水中，邊加邊搖勻。
[0237] 2.預(yù)包被板的制備：
[023引將ApoE- ε 4單克隆抗體（1)溶于抑=9. 6的0. 05M的碳酸鹽緩沖液中，制成預(yù) 包被液，在酶標(biāo)板（可購(gòu)自深圳金燦華公司）上每孔按0.1 μ g/孔加入100 μ 1，置4°C放置 18-24小時(shí)，取出，甩掉包被液，用樣品/洗涂緩沖液洗涂，經(jīng)1 (w/v) % BSA-0. 05M己醇胺封 閉16小時(shí)、過夜干燥后裝入鉛笛袋中抽真空密封，并置于4°C保存。
[0239] 3.結(jié)合抗體（ApoE- ε 4多克隆抗體（2))和酶聯(lián)物（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗 兔IgG抗體）（購(gòu)自北京中杉金橋公司）的稀釋比例均由方陣滴定實(shí)驗(yàn)確定，辣根過氧化物 酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體使用酶標(biāo)記物稀釋液稀釋。
[0240] 4.試劑盒的組成：
[0241] 預(yù)包被板：48/96孔
[024引 ApoE- ε 4校準(zhǔn)品（原料購(gòu)自上海聯(lián)碩公司）；7個(gè)；7X 1. 0ml (濃度分別為25ng/ ml、10ng/ml、5ng/ml、2. 5ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml、0. 25ng/ml)
[024引 ApoE- ε 4 結(jié)合抗體；1 X 10ml (經(jīng) 1:5000 稀釋）
[0244] 酶聯(lián)物；1 X 10ml (經(jīng) 1:5000 稀釋）
[0245] 濃縮洗涂液（25XPBS-Tween 20) ;lX20ml
[0246] 顯色劑 A;1X6. 0ml
[0247] 顯色劑 B;1X6. 0ml
[024引 終止液；1 X 6. 0ml