] (C)腫瘤體積大小比較（*p<0. 05, **p<0. 01)。
[0047] 圖9、DLB化PDX腫瘤塊Western blot檢測(cè)。左側(cè)為檢測(cè)的不同分子，P2為CD40-N 處理組，C0N2為對(duì)照組，其中1-5分別表示5只老鼠腫瘤塊樣品，CD40-N表示CD40-N處理 組，1-3表示3只老鼠腫瘤塊樣品。
[0048] 圖10、功能性CD40-N可W減輕DSS誘導(dǎo)的急性腸炎模型癥狀。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過在多種宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)研究，首次通過 序列優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了利用酵母細(xì)胞重組表達(dá)CD40蛋白氨基端胞外區(qū)。本發(fā)明人優(yōu)化方案解決 了現(xiàn)有技術(shù)中難W利用酵母細(xì)胞重組表達(dá)CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的技術(shù)難題。并且，本發(fā) 明人還首次論證了 CD40蛋白氨基端胞外區(qū)對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用，可W作為一種抗腫 瘤藥物；其還可W抑制炎癥，如腸炎。
[0050] 蛋白氨基端胞外區(qū)（CD40-N) 陽化U CD40-N是CD40蛋白的氨基端胞外段序列，它因?yàn)闆]有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)序列，但可W和 CD4化信號(hào)結(jié)合而不傳遞信號(hào)，因此可W實(shí)現(xiàn)阻斷該信號(hào)通路的作用。 陽化引作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的CD40-N是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋 白，其不包含CD40蛋白第20位脯氨酸的蛋白。
[0053] 經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的CD40-N也包括在本發(fā) 明中。CD40-N或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的 序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述 技術(shù)可W很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。運(yùn)些技術(shù)使本領(lǐng)域人員 認(rèn)識(shí)到，一般來說，在一種多膚的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性。見 Watson 等，Mole州Iar Biology of The Gene，第四版，1987,The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224〇
[0054] 本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的CD40-N，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效 性、代謝、和/或蛋白的效力而加 W修飾或改良的CD40-N。所述經(jīng)過修飾或改良的CD40-N 可W是一種CD40-N的共輛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。也就是說，任何不影 響CD40-N的生物活性或不影響CD40-N在畢赤酵母中表達(dá)的變化形式都可用于本發(fā)明中。 陽化日]在獲得了 CD40-N的氨基酸序列后，編碼CD40-N的編碼序列是易于獲得的。作為本 發(fā)明的優(yōu)選方式，其是一種經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列，較佳地其具有SEQ ID N0:2中第16-537 位所示的編碼區(qū)序列，利用其可W-定程度地提高表達(dá)效率。此外，編碼CD40-N的編碼序 列也可W是SEQ ID N0:2中第16-537位所示的編碼區(qū)序列的簡并的變異體。如本文所用， "簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與SEQ ID N0:2中第16-537位 所編碼的氨基酸序列相同，但核巧酸序列與SEQ ID N0:2中第16-537位所示序列有差別的 核酸序列。
[0056] 本發(fā)明的CD40-N的編碼通常可W用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。 例如，本領(lǐng)域人員可W通過化學(xué)合成法來得到編碼CD40-N的編碼序列。然后可將該編碼序 列引入表達(dá)載體和細(xì)胞中。
[0057] 蛋白氨基端胞外區(qū)（CD40-腳的重組表達(dá)
[0058] 本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，CD40-N在利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)，蛋白 在表達(dá)過程中會(huì)易于形成包涵體，表達(dá)效率很低；并且通過變復(fù)性操作后，蛋白活性變得不 理想。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，研究之初，本發(fā)明人克隆了 CD40-N的全部序列（CD40蛋白第 20-193位，174aa)，在將其編碼序列克隆入畢赤酵母后，發(fā)現(xiàn)無法實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)。之后，本 發(fā)明人嘗試了多種多樣的優(yōu)化表達(dá)方案，意外地發(fā)現(xiàn)在編碼序列中刪除CD40蛋白第20位 脯氨酸的編碼序列后，可W在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)良好的表達(dá)。較佳地，采用密碼子優(yōu)化且排除 了 CD40蛋白第20位的脯氨酸的編碼序列后，不僅表達(dá)量非常高，表達(dá)穩(wěn)定，并且蛋白可W 獲得正確折疊加工，生物活性非常理想。
[0059] 為了實(shí)現(xiàn)CD40-N的重組表達(dá)，本發(fā)明還提供了包含CD40-N的編碼序列的表達(dá)載 體，W及用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。
[0060] 本發(fā)明所述的表達(dá)載體是適用于畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)載體，其中含有CD40-N 的表達(dá)盒。如本文所用，所述的"表達(dá)盒"是指包含有表達(dá)目的多膚（本發(fā)明中為CD40-N) 所需的所有必要元件的基因表達(dá)系統(tǒng)，通常其包括W下元件：啟動(dòng)子、編碼多膚的基因序 列，終止子；此外還可選擇性包括信號(hào)膚編碼序列等；運(yùn)些元件是操作性相連的。
[0061] 將所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的重組畢赤酵母，從 而可表達(dá)CD40-N。較佳地，所述的表達(dá)載體先進(jìn)行線性化，之后轉(zhuǎn)化畢赤酵母。用重組DNA 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物如畢赤酵母 時(shí)，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：電轉(zhuǎn)化、憐酸巧共沉淀法、顯微注射、脂質(zhì)體包裝等；較佳 地選用電轉(zhuǎn)化。
[0062] 本發(fā)明人構(gòu)建的CD40-N畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過高密度發(fā)酵的方法，獲得較為大 量的有功能的蛋白。利用本發(fā)明的酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)蛋白，分泌到培養(yǎng)上清的目 的蛋白超過總蛋白的50%，非常利于后續(xù)純化操作獲得較高純度的蛋白。
[0063] 基于此本發(fā)明人還成功建立了超濾-S巧hadex G-50-Q Se地arose FF的純化技術(shù) 方案，可W簡單有效的獲得大量的蛋白。
[0064] 糖基化修飾是CD40蛋白一個(gè)保守的翻譯后修飾，CD40-N有兩個(gè)保守的N-糖基化 修飾位點(diǎn)（Asnl53, AsnlSO)。而糖基化修飾在酵母表達(dá)系統(tǒng)與哺乳系統(tǒng)表達(dá)不同，純化的 CD40-N大小在略大于25邸a位置，與理論值19邸a不同，運(yùn)是由于酵母中糖基化修飾的結(jié) 果。有趣的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在哺乳細(xì)胞里面表達(dá)的CD40-N和酵母中表達(dá)的CD40-N大小 接近。 陽0化]本發(fā)明人建立了一個(gè)簡單高效的CD40-N表達(dá)純化系統(tǒng)，為其科研和臨床應(yīng)用奠 定了基礎(chǔ)。
[0066] CD40-N及其用途
[0067] CD40kCD40信號(hào)通路是免疫系統(tǒng)中一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號(hào)通路，一方面可W促進(jìn)抗 原遞呈細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞）的抗原遞呈能力；另一方面可W激活B細(xì)胞，促進(jìn)抗體產(chǎn)生； CD40介導(dǎo)的信號(hào)通路在中樞免疫耐受的建立過程中也起關(guān)鍵的作用，因而CD40kCD40已 經(jīng)成為抑制移植排斥、防療自身免疫性疾病等的重要祀點(diǎn)。
[0068] 本發(fā)明人利用重組表達(dá)獲得的CD40-N，進(jìn)行了一系列的功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了 CD40-N 可W在體內(nèi)抑制腫瘤的生長。基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 CD40-N的用途，用于 制備抑制腫瘤的藥物組合物。 W例所述的CD40-N還用于：阻斷CD40-CD4化信號(hào)通路；阻斷CD40介導(dǎo)的非經(jīng)典 NF- K B信號(hào)通路的激活訊/或降低細(xì)胞內(nèi)原癌基因 cMYC的表達(dá)。
[0070] 所述的CD40-N還用于：抑制炎癥，特別是腸炎。其可使得炎癥癥狀發(fā)生顯著的改 善。
[0071] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量（如0. 000001-50wt% ;較佳的 0. 00001-20wt% ;更佳的，0.0 OOl-lOwt% )的所述的CD40-N，W及藥學(xué)上可接受的載體。
[0072] 本發(fā)明的組合物可直接用于抑制腫瘤或抑制炎癥。此外，還可同時(shí)與其它治療劑 或輔劑聯(lián)合使用。
[0073] 通常，可將CD40-N配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其 中抑通常約為5-8,較佳地，抑約為6-8。
[0074] 如本文所用，術(shù)語"含有"表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物 中。因此，術(shù)語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術(shù)語"含有"中。如本文所用，術(shù) 語"有效量"或"有效劑量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物 所接受的量。
[0075] 如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良 副反應(yīng)（如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)）的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上 可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0076] 本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的CD40-N W及藥學(xué)上可接受的載體。運(yùn)類 載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑 應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可W被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有 葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制 造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0077] 本發(fā)明所述的CD40-N的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等 而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可W由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定（例如通 過臨床試驗(yàn)）。所述的因素包括但不限于：所述的CD40-N的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利 用率、代謝、半衰期等；患者所