色脫色后，發(fā)現(xiàn)在目的蛋白大小區(qū)域（27KDa)有一個明顯的逐漸增加的蛋白帶（圖3A)。接 下來用CD40抗體（af632R&D)對樣品進行免疫蛋白印記（Western blot)分析。接下來，利 用此抗體對1號菌株誘導表達的上清進行免疫印跡分析，該條帶被CD40抗體特異性識別， 證明該條帶為CD40-N (圖3B)。
[0174] 實施例3、CD40-N表達菌株高密度發(fā)酵研究 陽1巧]為了獲得高表達的CD40-N，接下來本發(fā)明人對所獲得表達菌株進行了高密度發(fā) 酵。將菌株擴大培養(yǎng)后灌裝于發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。在溶氧控制為35%，攬拌速 度為65化pm，溫度設置為30°C的條件下，開始發(fā)酵，每隔4小時取樣測OD值，酵母生長曲線 如圖（圖4A)。酵母菌株在發(fā)酵罐中生長迅速，0D600達到70時，甘油被耗盡，使用50%甘 油補料繼續(xù)培養(yǎng)，待0D600達到110后約（20小時），加入甲醇開始誘導。誘導過程中，每隔 4小時收集一次發(fā)酵液，誘導60小時后下結束發(fā)酵。 陽176] 發(fā)酵液離屯、后取上清進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色（圖5B)。上清中目的 蛋白不斷積累增加，在36小時后不再明顯增加，此后蛋白維持在一定水平。 陽177] 實施例4、CD40-N純化和糖基化鑒定
[0178]離屯、收集酵母培養(yǎng)上清，化發(fā)酵液上清被收集后使用截留3kD超濾膜進行超濾， 收集超濾后截留的組分體積約為500ml。接下來樣品用AKTA儀器進行Se地adexG-50凝膠 層析。收集0D280紫外吸收峰下的樣品進行聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，考馬斯亮藍 染色顯示含目的蛋白組分出現(xiàn)在第一個紫外吸收峰中（圖5A)。收集到樣品約750ml，運時 候鹽分和部分色素已經(jīng)被去除。將含有目的蛋白組分用Q-Se地arose-FF陰離子交換柱繼 續(xù)純化，0-1. OMNaCl線性洗脫，目的蛋白組分在3%B通道處被收集獲得（第一個紫外吸收 峰1600ml處，見圖5B箭頭處），共收集到3管，分別40ml。分子篩收集到樣品和離子交換 純化后獲得的樣品進行SDS-PAGE考馬斯亮藍染色后結果見圖5C。 陽1巧]為了證實表達純化的蛋白大?。s27邸a)與理論大?。?9邸a)是不是由于糖基 化導致的，將純化的蛋白用去除N-糖基化的糖膚酶F(PNGase巧處理，發(fā)現(xiàn)處理后蛋白大小 變小為19KD，與理論一致（圖抓），因此該蛋白發(fā)生了 N-糖基化。 陽180] 實施例5、CD40-N的體外功能 陽1W] 1、功能性CD40-N可W體外阻斷CD40-CD4化信號介導的非經(jīng)典NF- K B信號通路 陽182] 為了探索CD40-N是否具有阻斷CD40介導的信號轉導功能，進行如下實驗。首先建 立〔040激活的細胞系系統(tǒng)：8148細胞系在〔040激活性單抗628-5作用下非經(jīng)典^-1〇6信 號通路激活，TRAF3隨時間增加而減少，p52隨時間增加而增多。而在CD40-N加入后TRAF3 的降解沒有對照組明顯，PlOO剪切成p52也沒有對照組多（圖6A)，因此證明CD40-N部分 阻斷了 G28-5的對非經(jīng)典NF- K B信號通路激活作用。 陽183] 在另外一個實驗中，BJAB細胞在CD40L作用24小時后PlOO剪切成p52明顯增加， 在僅僅加入0. lug/ml CD40-N后，p52的增加相對于對照組減少，且運種減少隨著CD40-N濃 度增加而更加明顯（圖6B)。
[0184] 上述實驗證明，CD40-N可W體外阻斷CD40介導的非經(jīng)典NF- K B信號通路激活。 陽化日]2、功能性CD40-N可W減少病人來源彌漫型大B細胞淋己瘤細胞值LBCL)的存活 陽186] 為了探索CD40-N是否具有功能，在體外培養(yǎng)的病人來源的彌漫性大B細胞淋己瘤 細胞值LB化PDC)和小鼠骨髓來源干細胞度MSC)共培養(yǎng)中加入CD40-N檢測細胞存活情況。 在沒有CD40-N加入時，可W看到BMSC能增加 DLB化PDC的存活率從沒有加入時的3. 05% 到加入后的31 % (圖7左圖，ANNEXIN V-，7-AAD-細胞），在加入CD40-N后，DLBCL PDC存 活降低為5. 2% (圖7)。 陽187] 實施例6、CD40-N的體內功能
[0188] 1、功能性CD40-N可W減弱病人來源彌漫型大B細胞淋己瘤值LBCL)體內生長
[0189] 既然CD40-N可W減少DLB化PDC細胞體外存活，那么它能不能減弱DLB化腫瘤體 內生長呢？本發(fā)明人建立了 PDX(病人來源的腫瘤移植物）腎囊膜模型進行研究。
[0190] PDX腎囊膜模型：將病人的淋己瘤組織塊移植到裸鼠腎囊膜下，約 2個月后腫瘤長出，取出腫瘤再次移植到新的裸鼠中，如此傳遞5代，腫瘤組織穩(wěn)定。將穩(wěn)定 的腫瘤組織塊移植到裸鼠腎囊膜一周后，腹腔注射CD40-N(20mg/kg)或者 等體積PBS (對照組）于小鼠，一周S次，2個月后取出腫瘤塊分析。 陽1W] 2個月后觀察DLB化腫瘤的體內生長情況，發(fā)現(xiàn)CD40-N處理組腫瘤無論是質量和 體積都顯著小于對照組，如圖8。 陽19引 因此，CD40-N是可W阻斷DLB化腫瘤體內生長。
[0193] 2、功能性CD40-N通過cMYC減弱病人來源彌漫型大B細胞淋己瘤值LBCL)體內生 長
[0194] 為了探索CD40-N抑制DLB化PDX腫瘤大小的機制，本發(fā)明人檢測了兩組腫瘤中與 腫瘤生長和生長密切相關的分子表達情況。 陽1巧]首先，本發(fā)明人檢測發(fā)現(xiàn)P100剪切成p52在CD40-N作用后是減少的，運證明 CD40-N在體內是有活性的。 陽196] 接下來，本發(fā)明人檢測了腫瘤組織中的cMYC、P-STAT3、切ClinDl表達情況，結果 發(fā)現(xiàn)cMYC在CD40-N處理后比對照組減少，而P-STAT3XY化INDl等沒有明顯減少（圖9)。
[0197] 3、功能性CD40-N可W減輕急性腸炎癥狀
[0198] 在含DSS誘導急性腸炎模型（含2. 75% DSS的水喂C57小鼠6天）中，實驗組小 鼠間隔一天腹腔注射CD40-N巧mg/kg)，對照組用PBS處理。第7天開始喂DSS的小鼠體重 開始下降，第8天時，PBS處理組小鼠體重平均降到最高體重的76%左右，而CD40-N注射組 體重只降低為最高體重的88%，如圖10。
[0199] 因此，功能性CD40-N可W減輕DSS誘導的急性腸炎模型癥狀。 陽200] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 W對本發(fā)明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的用途，用于制備抑制腫瘤或抑制炎癥的藥物組合物。2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CD40蛋白氨基端胞外區(qū)是CD40蛋白 第21-193位氨基酸序列的蛋白。3. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤是淋巴瘤；或所述的炎癥是腸 炎。4. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物還用于： 阻斷⑶40-⑶40L信號通路； 阻斷⑶40介導的非經(jīng)典NF- κ B信號通路的激活；和/或 降低細胞內原癌基因 cMYC的表達。5. -種CD40蛋白氨基端胞外區(qū)，其特征在于，其是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列 的蛋白；較佳地，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。6. -種多核苷酸，其編碼權利要求5所述的CD40蛋白氨基端胞外區(qū)；較佳地，其核苷 酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示。7. -種用于抑制腫瘤或抑制炎癥的藥物組合物，其含有權利要求5所述的CD40蛋白氨 基端胞外區(qū)。8. -種重組表達載體，其中包含有權利要求6所述的多核苷酸。9. 一種重組酵母細胞，其中包含有權利要求6所述的多核苷酸或含有所述多核苷酸的 重組表達載體。10. -種重組表達⑶40蛋白氨基端胞外區(qū)的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 提供一重組表達載體，其包含CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的編碼序列，所述的CD40蛋 白氨基端胞外區(qū)是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白； (2) 將（1)的重組表達載體轉化酵母細胞，獲得重組酵母細胞；和 (3) 培養(yǎng)（2)的重組酵母細胞，從而表達CD40蛋白氨基端胞外區(qū)。11. 如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的酵母細胞是畢赤酵母細胞。12. 如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的CD40蛋白氨基端胞外區(qū)的編碼序 列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種CD40胞外區(qū)的表達純化及其用途。首次通過優(yōu)化實現(xiàn)了利用酵母細胞重組表達CD40蛋白氨基端胞外區(qū)。并且首次論證了CD40蛋白氨基端胞外區(qū)對腫瘤細胞有明顯的抑制作用，可以作為一種抗腫瘤藥物。
【IPC分類】A61P29/00, C12R1/84, C12N1/19, C12N15/12, A61P35/00, A61K38/17, C07K14/705, C12N15/81
【公開號】CN105693845
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】張笑人, 詹譽
【申請人】中國科學院上海生命科學研究院
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2014年11月24日