要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給 藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的CD40-N每天W約0. 00001mg-50mg/kg動(dòng)物體重（較佳的 0.0 OOlmg-lOmg/kg動(dòng)物體重）的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫 切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
[0078] 本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤或炎癥的方法，包括給予受試者有效量的CD40-N。
[0079] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第=版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0080] I.材料與方法
[0081] 實(shí)驗(yàn)材料
[0082] 己斯德畢赤酵母GSl 15 (獲自復(fù)旦大學(xué)），大腸桿菌DH-5 a菌株燈IANGEN公司）， 肥K293T、服0、BJAB細(xì)胞系獲自ATCC。 陽〇8引相關(guān)載體
[0084] PPIC9K載體（復(fù)旦大學(xué)分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于敏實(shí)驗(yàn)室）。 陽〇85] 試劑盒
[0086] 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Axygen)、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（Axygen)、普通 質(zhì)粒小提試劑盒（A巧gen)、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒CTransGene Biotech)。質(zhì)粒大量抽 提試劑盒（MAC肥REY-NAGEL)K0D-plus 燈0Y0B0)。
[0087] 分子量標(biāo)記
[0088] DNA 分子量標(biāo)記：DL2000 (TAKARA)，Trans2Kplus (TransGene Biotech)。
[0089] 蛋白分子量標(biāo)記：化geRuler Plus Prestained Protein Ladder (26617The;rmo scientific)。
[0090] 主要溶液配制 陽0川 IOXYNB :溶解134g YNB于1000 ml去離子水中，磁力攬拌溶解，0.22um濾器過濾 除菌。
[0092] 10XD(20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1000 ml水中，121°C高壓滅菌20分 鐘。
[0093] 生物素巧00X):即0.02 %生物素，稱取0.0 lg生物素加入50ml去離子水中 0. 22um濾器過濾除菌。
[0094] YTO培養(yǎng)基（100mL):酵母提取物Ig,膜蛋白腺2g。去離子水定容至90ml，121°C 高壓滅菌15分鐘后加入20 %葡萄糖溶液10ml。
[0095] YTO平板（100mL):酵母提取物Ig，膜蛋白腺2g，瓊脂1. 5g。去離子水定容至90ml， 12rc高壓滅菌15分鐘后加入20%葡萄糖溶液10ml，倒平板。
[0096] MDOns-)平板（100mL):瓊脂1. 5g去離子水定容至80ml，121°C高壓滅菌15分鐘 后加入IOXYNB溶液IOml,生物素巧OOX )200ul，20 %葡萄糖溶液IOml,倒平板。
[0097] MM平板（100mL):瓊脂1.5g，去離子水定容至80ml，121°C高壓滅菌15分鐘后加入 IOXYNB 溶液 IOml,生物素巧00X)200ul，10% (v/v)甲醇 IOml,倒平板。 陽09引 BMGY培養(yǎng)基（IL):酵母提取物lOg，膜蛋白腺20g，溶于700ml去離子水中，121°C 高壓滅菌20分鐘，冷卻至室溫，加入IM憐酸鐘緩沖液（P冊(cè).0) 100mL，10 X YNB溶液100mL， 生物素巧OOX) 2ml，10 % (v/v)甘油 100ml。
[0099] BMMY培養(yǎng)基（IL):酵母提取物lOg，膜蛋白腺20g，溶于700ml去離子水中，121°C 高壓滅菌20分鐘，冷卻至室溫，加入IM憐酸鐘緩沖液（P冊(cè).0) 100mL，10 X YNB溶液100mL， 生物素巧OOX) 2ml，無菌去離子水90ml，使用時(shí)加甲醇（1% )。 陽 100] BSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基（IL) :Sodium Citrate .2&0 1.5g，CaS〇4.H2〇 1. Olg,KzSOJSg, M拆047. 32g，K0H4. 13g，85% H3P〇427ml，甘油 32ml，補(bǔ)去離子水至 IL，12TC I. 5kg/cm2 高壓 滅菌20分鐘。
[0101] PTMl 溶液（IL) :CuS〇4 ? 5&0 6g，MnS〇4 ?&0 3g，H3BO40.0 2g，ZnCl220g，KIO. 8g， NaMo〇4 ? 2&0 0. 2g，C0CI2 ? 6H2O 0. 49g，F(xiàn)eS〇4 ? 7&0 65. 06g，HzSOJOml，CaS〇4 ? 2&0 0. 5g， M拆O4I. 71g，生物素0. 2g，0. 22um濾器過濾除菌2ml/L。
[0102] CD40-N基因克隆
[0103] 根據(jù)Genbank上CD40巧22bp)基因序列設(shè)計(jì)并合成引物：
[0104] 正向引物：CGCCTCGAGAAAAGA CCAGAACCACCCACTGCA(SEQ ID NO:4)； 陽 1 化]巧向引物：TTAATAATGCGGCCGCTCATCTCAGCCGATCCTG(沈Q ID NO:5)； 陽106] 將培養(yǎng)的RKO細(xì)胞裂解抽取RNA，采用化izol法從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織樣品中抽 提 RNA。
[0107] RNA 經(jīng) Nano化op 測(cè)定濃度后，使用 Transcript First Strand Synthesis Supermix (TransGene Biotech)反牽專錄 mRNA 成 cDNA。
[0108] 應(yīng)用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR，獲得含有CD40-N基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0109] PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳120v20分鐘，然后用膠回收試劑盒（Axygen公司） 回收。
[0110] PCR回收產(chǎn)物、載體PPIC9K分別用化Ol NotI雙酶切，連接獲得連接產(chǎn)物， PPIC9K-CD40-N。將連接產(chǎn)物化DH-5a。篩選陽性克隆。陽性克隆菌株抽提質(zhì)粒鑒定正確 性，菌液等體積加入50%無菌甘油-80°C保存。 陽111] CD40-N密碼子優(yōu)化，并構(gòu)建到PIC9K上
[0112] 根據(jù)NCBI CD40基因胞外段序列送公司序列優(yōu)化合成。
[0113] CD40-N天然序列如SEQ ID NO: 3。密碼子優(yōu)化后的序列如沈Q ID NO:2中第16-537 位：
[0114] CGCCTCGAGAAAAGAGAGCCACCCACAGCTTGCAGAGAGAAACAATATCTGATTAACTCCCAGTGTTGC TCTCTGTGCCAACCAGGTCAGAAATTGGTGTCTGATTGCACTGAATTTACCGAGACAGAATGCCTTCCATGCGGCGA ATCAGAATTCCTTGATACCTGGAATCGTGAAACTCACTGTCATCAACATAAGTACTGTGATCCTAACTTAGGATTGA GGGTACAGCAAAAGGGAACTTCCGAAACCGACACAATCTGTACTTGTGAGGAGGGTTGGCATTGTACTTCAGAAGCT TGTGAAAGTTGTGTCTTGCACAGATCCTGTTCCCCTGGTTTTGGTGTCAAGCAAATTGCAACGGGTGTCTCTGATAC TATATGTGAACCTTGCCCCGTTGGCTTTTTCTCTAACGTTAGTTCTGCCTTCGAGAAGTGTCACCCATGGACTTCAT GTGAGACGAAAGATTTAGTTGTTCAGCAAGCTGGAACCAATAAAACAGACGTGGTTTGTGGACCTCAAGACAGACTA CGATAAGCGGCCGCATTATTAA(SEQ ID NO:2)
[0115] 將合成的序列、載體PPIC9K分別用化oI/Notl雙酶切。雙酶切產(chǎn)物切膠回收，連 接，轉(zhuǎn)化，搖菌，小抽鑒定。
[0116] 構(gòu)建CD40-N表達(dá)質(zhì)粒 陽117] 引物設(shè)計(jì)如下： 陽1化]正向引物（2條）：
[0119] CD40-S-F :TGAATGATGCGGCCGCGAAATGGTTCGTCTGCCTCTGC(沈Q ID N0:6);
[0120] CD40-M-F ：TTAATAATGCGGCCGCGAAATGCCAGAACCACCCACTG CA(SEQ ID NO :7)； 陽121] 反向引物（I條）：
[0122] CD40-FLAG-R :CGCCTCGAGTCACTTGTCATCATCGTCCTTGTAGTCTCTC AGCCGATCCTG(沈Q ID NO:8)O
[0123] 利用前述獲得的服0細(xì)胞系cDNA作為模板，分別利用引物CD40-S-F/CD40-化AG-R 進(jìn)行PCR獲得含信號(hào)膚的CD40胞外段基因，引物CD40-M-F/CD40-化AG-R獲得成熟CD40胞 外段基因。
[0124] PCR回收產(chǎn)物、載體PPIC9K分別用化oI/Notl雙酶...