al Basis of Therapeutics"，Ch. Ip. 1)〇
[0119] 在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了用于治療、緩和或預防代謝綜合征的粉末形 式的組合物，其包含所述大規(guī)模方法中的體外生長的葡萄漿果細胞的細胞系愈傷組織培養(yǎng) 物，其中葡萄漿果細胞的細胞系愈傷組織培養(yǎng)物源自葡萄漿果橫切片、葡萄漿果皮、葡萄漿 果肉、葡萄種子、有種子或無種子栽培株的葡萄胚芽或者葡萄種皮中的一或多種；其中葡萄 漿果細胞的細胞系愈傷組織培養(yǎng)物包含的白藜蘆醇的量為至少l〇〇〇mg/kg粉末。在本發(fā)明 的一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述大規(guī)模方法的實施方案生產(chǎn)的葡萄細胞中至少90%的 白藜蘆醇是反式-葡糖苷白藜蘆醇。
[0120] 根據(jù)一些實施方案，所制備的果實細胞中不同多酚的相對量與其在農(nóng)業(yè)葡萄果實 中的相對量不同。這在實施例3、表9中清晰可見，其中將在根據(jù)本發(fā)明的實施方案大規(guī)模 生產(chǎn)的干燥的葡萄細胞培養(yǎng)物中總的白藜蘆醇與葡萄中白藜蘆醇的量比較。根據(jù)一些實施 方案，某些多酚的量在所制備的果實細胞與其在農(nóng)業(yè)葡萄果實中的量相比增加。根據(jù)一些 實施方案，白藜蘆醇的量在果實細胞中增加。根據(jù)一些實施方案，果實細胞（可以是葡萄細 胞）在干燥為粉末之后其中白藜蘆醇的量為1000-50000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于1000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于3000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于5000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于10000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于20000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于30000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于40000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于50000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于60000mg/kg。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方 案，在果實細胞干燥為粉末之后白藜蘆醇的量大于70000mg/kg。
[0121] 根據(jù)一些實施方案，所制備的果實細胞中各種成分的相對量與其在農(nóng)業(yè)葡萄果實 中的相對量不同。根據(jù)一些實施方案，所述果實細胞中糖的相對量與農(nóng)業(yè)葡萄果實中糖的 相對量相比降低。
[0122] 根據(jù)一些實施方案，干燥的果實細胞含有高達10% w/v甜味糖。根據(jù)本發(fā)明的一 些實施方案，干燥的果實細胞含有高達15% w/v甜味糖。根據(jù)一個實施方案，干燥的果實 細胞含有10-15% w/v甜味糖。根據(jù)一個實施方案，干燥的果實細胞含有15-20% w/v甜味 糖。根據(jù)一些實施方案，根據(jù)本發(fā)明的大規(guī)模方法制備的果實細胞含有少于10% w/v甜味 糖。根據(jù)一些實施方案，所述果實細胞含有少于5% w/v甜味糖。根據(jù)一些實施方案，所述 果實細胞含有少于3 % w/v甜味糖。根據(jù)一些實施方案，所述果實細胞含有少于2 % w/v甜 味糖。根據(jù)一些實施方案，所述果實細胞含有少于l%w/v甜味糖。根據(jù)一些實施方案，所 述果實細胞含有約1 % w/v甜味糖。如本文所用，短語"甜味糖"是指提供甜味的糖，如蔗 糖、葡萄糖和果糖。
[0123] 根據(jù)一個實施方案，干燥的果實細胞含有少于20%w/v甜味糖。根據(jù)一個實施方 案，干燥的果實細胞含有少于30% w/v甜味糖。
[0124] 根據(jù)一些實施方案，將果實細胞干燥，從而濃縮在其中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，包括糖。根據(jù) 一些實施方案，所述物質(zhì)濃縮5倍。根據(jù)一些實施方案，所述物質(zhì)濃縮10倍。根據(jù)一些實施 方案，所述物質(zhì)濃縮15倍。根據(jù)一些實施方案，所述物質(zhì)濃縮20倍。根據(jù)一些實施方案， 所述物質(zhì)濃縮25倍。根據(jù)一些實施方案，所述物質(zhì)濃縮30倍。
[0125] 根據(jù)一些實施方案，根據(jù)本發(fā)明的大規(guī)模方法制備的果實細胞是無味的；根據(jù)其 它的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的大規(guī)模制備的果實細胞是有味的。本發(fā)明的實施方案涉及用 于大規(guī)模體外生產(chǎn)果實細胞的方法。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法不包括提取果 實細胞。出人意料的是，根據(jù)本文描述的大規(guī)模方法制造的所生產(chǎn)的果實細胞顯示包含多 酚的量高。
[0126] 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供體外生產(chǎn)生長的葡萄漿果細胞的細胞系愈傷組 織培養(yǎng)物的大規(guī)模方法，所述方法包括：
[0127] 將葡萄細胞在瓶中生長；
[0128] 將葡萄細胞從瓶接種至第一生物反應(yīng)器中；以及收獲所產(chǎn)生的葡萄細胞。
[0129] 在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了體外生產(chǎn)生長的葡萄漿果細胞的細胞系愈傷 組織培養(yǎng)物的大規(guī)模方法，所述方法包括：
[0130] 將葡萄細胞在瓶中生長；
[0131] 將葡萄細胞從瓶接種至第一生物反應(yīng)器中；將葡萄細胞從所述第一生物反應(yīng)器接 種至另一個生物反應(yīng)器，其中所述另一個生物反應(yīng)器是最后的生物反應(yīng)器或者是中間生物 反應(yīng)器，及可以提供使用一或多個中間生物反應(yīng)器的一些更多的步驟及其中所述第一生物 反應(yīng)器和所述另一個生物反應(yīng)器中的至少一個是一次性的；及
[0132] 從最后的生物反應(yīng)器中收獲葡萄細胞；
[0133] 其中將從最后的生物反應(yīng)器收獲的葡萄細胞干燥。
[0134]"一次性生物反應(yīng)器"是指具有一次性包袋的生物反應(yīng)器，其可以是代替培養(yǎng)容器 的一次性使用的包袋。所述一次性包袋通常是由三層或更多層塑料薄片制成。在本發(fā)明的 一些實施方案中，一層是由聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯或LDPE制成，以提供機械穩(wěn)定 性。第二層是使用尼龍、PVA或PVC制成，其作為氣體屏障。最后，接觸層由PVA或PP制成 或者是另一聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯或LDPE層。對于醫(yī)學應(yīng)用，接觸產(chǎn)物的一次性 使用的材料必須通過European Medicines Agency或者其它地區(qū)的相似權(quán)威機構(gòu)認證。
[0135] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，一次性生物反應(yīng)器由一或多層的聚乙烯制成。在本 發(fā)明的一些實施方案中，一次性生物反應(yīng)器是由聚乙烯內(nèi)層和外層及中間尼龍層制成。
[0136] 通常地，有兩種不同方法構(gòu)建一次性使用的生物反應(yīng)器，區(qū)別在于用于攪動培養(yǎng) 基的方式。
[0137] 一些一次性使用的生物反應(yīng)器使用攪拌器，像常規(guī)生物反應(yīng)器一樣，但是攪拌器 整合在塑料包袋中。密閉的包袋和攪拌器提前滅菌。在使用中，將包袋安裝在生物反應(yīng)器 中，及將攪拌器與機械性或磁性驅(qū)動器連接。
[0138] 其它一次性使用的生物反應(yīng)器是通過搖擺運動攪動的。其它一次性使用的生物反 應(yīng)器是空氣攪拌的（airlift)生物反應(yīng)器，其中通過空氣的導入攪動反應(yīng)培養(yǎng)基及使其通 氣。這種類型的生物反應(yīng)器不需要在一次性使用包袋內(nèi)部的任何機械性攪動器。
[0139] 根據(jù)一些實施方案，制備果實細胞的大規(guī)模方法包括許多隨后的步驟。根據(jù)本發(fā) 明的一些實施方案，在每個步驟中制備的果實細胞的量大于在先前步驟中制備的量。進一 步地，在每個步驟中制備的果實細胞接種或收獲以用作大規(guī)模方法中下一步的起始物。在 大規(guī)模方法的最后步驟中，通常使果實細胞生長直至其達到生長曲線圖的平臺期。
[0140] 使用本發(fā)明的大規(guī)模方法的優(yōu)勢在實施例章節(jié)中是清楚的并得到證實。如在實施 例2、實驗2中可見，使用補充的GamborgB5培養(yǎng)基的紅葡萄細胞（RGC)的生物量高于與在 非補充的GamborgB5培養(yǎng)基中獲得的生物量。進一步地，甚至在大規(guī)模生物反應(yīng)器中，使 用含有不同濃度的鎂、硝酸鹽和磷酸鹽（KN03、MgS04、MgN03、NaH2P04)的GamborgB5培養(yǎng)基 導致所產(chǎn)生的細胞中的高水平白藜蘆醇。
[0141] 表4和實施例2、實驗3顯不在大規(guī)模一次性生物反應(yīng)器中在補充的培養(yǎng)基中生長 的葡萄細胞中總多酚及白藜蘆醇水平高于在Erlenmeyer瓶中生長的葡萄細胞中獲得的水 平，即分別為910mg/l和203mg/l。與其它人的觀測結(jié)果不同，這是首次證實在大規(guī)模一次 性1000-5000升生物反應(yīng)器中果實植物細胞系的成功生長，具有較高水平白藜蘆醇和多酚 產(chǎn)生。
[0142] 表7和實施例2、實驗7顯示兩種培養(yǎng)基頂1培養(yǎng)基和補充有鎂、磷酸鹽和硝酸鹽 的Gamborg B5對于由細胞產(chǎn)生的白藜蘆醇的量的影響。在由無菌的一次性透明塑料容器 制成的20L生物反應(yīng)器中評定該影響，并與在A. Decendit (1996) Biotechnology Letters 中公開的數(shù)據(jù)進一步對比，其中細胞是生長在20L玻璃容器中的頂1培養(yǎng)基中。結(jié)果表明 在一次性生物反應(yīng)器中頂1培養(yǎng)基中生長的紅葡萄細胞產(chǎn)生93mg/l白藜蘆醇（表7)，其比 在使用相同培養(yǎng)基（Decendit)的攪動的玻璃生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的水平的大約高3倍。此 外，當這些細胞在一次性生物反應(yīng)器中在補充的Gamborg B5培養(yǎng)基中生長時產(chǎn)生顯著高水 平的白藜蘆醇，即387mg/l。因此，這個實驗顯示使用一次性生物反應(yīng)器和含有不同濃度鎂、 硝酸鹽和磷酸鹽（KN0 3，MgS04，MgN03，NaH2P04)的Gamborg B5培養(yǎng)基的優(yōu)勢以及使用一次性 生物反應(yīng)器和補充的Gamborg B5培養(yǎng)基組合的優(yōu)勢。
[0143] 根據(jù)一些實施方案，使果實細胞在生物反應(yīng)器中生長。根據(jù)一些實施方案，設(shè)計生 物反應(yīng)器以使得能夠進行適當?shù)幕旌霞百|(zhì)量轉(zhuǎn)移，同時使剪切力和流體動力壓力強度最小 化。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，至少一個生物反應(yīng)器是一次性生物反應(yīng)器。其可以是第一 生物反應(yīng)器或者中間生物反應(yīng)器或者最后的生物反應(yīng)器或者其任意組合。根據(jù)本發(fā)明的一 些實施方案，一次性的生物反應(yīng)器是最后的生物反應(yīng)器，之后收獲細胞并干燥以形成粉末。
[0144] 根據(jù)本發(fā)明一個舉例的實施方案，第一步包括在瓶如Erlenmeyer或生物反應(yīng)器 中制備果實細胞。根據(jù)一些實施方案，第一步包括制備直至1.0L的果實細胞培養(yǎng)物。根據(jù) 進一步的實施方案，第一步包括制備直至1. 5L的果實細胞培養(yǎng)物。根據(jù)進一步的實施方 案，第一步包括制備直至2. 0L的果實細胞培養(yǎng)物。
[0145] 根據(jù)一些實施方案，使用玻璃、金屬或者塑料瓶進行第一步。根據(jù)一些實施方案， 該瓶是一次性的。根據(jù)進一步的實施方案，該瓶可以重新使用任何次數(shù)。根據(jù)一些實施方 案，該瓶在兩次使用之間通過任何適當方式滅菌。
[0146] 根據(jù)一些實施方案，第一步包括使用任何合適的培養(yǎng)基以使得果實細胞生長。根 據(jù)一些實施方案，用于使果實細胞生長的培養(yǎng)基包括細胞生長培養(yǎng)基、鹽、維生素、糖、激素 或者其任意組合。根據(jù)一些實施方案，細胞生長培養(yǎng)基是135631]113(^〖(631]113(^^6丨31.，￡叉口. Cell Res. 50:151，1968)，或者其任何變型。根據(jù)一些實施方案，Gamborg B5包含鹽如鎂、 磷酸鹽、硝酸鹽或其任何組合。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，Gamborg B5培養(yǎng)基包含KN03、 MgS04、NaH2P0 4S者其任何組合。根據(jù)一些實施方案，培養(yǎng)基包含Gamborg B5維生素或者其 任何組合。根據(jù)進一步的實施方案，培養(yǎng)基包含糖如蔗糖、Gamborg B5或者其任何組合。
[0147] 在本發(fā)明的實施方案中，加入Gamborg B5中的謂03的濃度為25mM-45mM。
[0148] 在本發(fā)明的實施方案中，加入B5Gamborg中的1%304的濃度為
[0149] 在本發(fā)明的實施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3的濃度為5mM-35mM。
[0150] 在本發(fā)明的實施方案中，加入Gamborg B5中的謂03的濃度為15mM-60mM。
[0151] 在本發(fā)明的實施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04濃度為0. 5mM-25mM。
[0152] 在本發(fā)明的實施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3濃度為lmM-50mM。
[0153] 在本發(fā)明的實施方案中，加入Gamborg B5中的謂03濃度為30mM-40mM。
[0154] 在本發(fā)明的實施方案中，加入B5Gamborg中的MgS04*度為5mM-10mM。
[0155] 在本發(fā)明的實施方案中，加入B5Gamborg中的1%勵3濃度為20mM-30mM。
[0156] 在本發(fā)明的實施方案中，將肌醇加入Gamborg B5中。
[0157] 在本發(fā)明的實施方案中，將H3B03加入Gamborg B5中。
[0158] 在本發(fā)明的實施方案中，將MnS04加入Gamborg B5中。
[0159] 在本發(fā)明的實施方案中，將NaH2P04加入GamborgB5中。
[0160] 在本發(fā)明的實施方案中，將生物素加入Gamborg B5中。
[0161] 在本發(fā)明的實施方案中，將D-泛酸f丐加入Gamborg B5中。
[0162] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約0.5mM肌醇加入Gamborg B5中。
[0163] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約0. 05mM H3B03加入Gamborg B5中。
[0164] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約0. 04mM MnS04加入Gamborg B5中。
[0165] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約ImM NaH2P04加入Gamborg B5中。
[0166] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約0. 004mM生物素加入Gamborg B5中。
[0167] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約0.2mM D-泛酸f丐加入Gamborg B5中。
[0168]在本發(fā)明的實施方案中，將大約 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4、5、6、7、8、9、10禮肌醇加入6&11113〇找85中。
[0169]在本發(fā)明的實施方案中，將大約 0? 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.1 mM H3B03加入 Gamborg B5 中。
[0170] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約 0? 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0? 09、0.1 mM MnS04加入 Gamborg B5 中。
[0171] 在本發(fā)明的實施方案中，將 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、3、4、 5、6、7、8、9、10mM NaH2P04加入 Gamborg B5 中〇
[0172] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約 0. 001、0. 002、0. 003、0. 004、0. 005、0. 006、0. 007、 0? 008、0? 009、0? 0 ImM 生物素加入 Gamborg B5 中。
[0173] 在本發(fā)明的實施方案中，將大約 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4mM D_泛酸f丐加入Gamborg B5中。
[0174] 在本發(fā)明的實施方案中，加入Gamborg B5中的蔗糖濃度為2-4%。在另一實施方 案中，濃度為大約3%。
[0175] 根據(jù)進一步的實施方案，酪蛋白可以包含在細胞生長培養(yǎng)基中。根據(jù)進一步的實 施方案，生長激素可以包含在細胞生長培養(yǎng)基中。根據(jù)進一步的實施方案，生長培養(yǎng)基包含 激素。根據(jù)一些實施方案，果實細胞不用添加激素而生長。
[0176] 根據(jù)一些實施方案可以在所述方法的一或多個階段使用的植物培養(yǎng)基的 例子包括但不限于：Anderson(Anderson，In Vitro 14:334,1978 ;Anderson，Act. Hort.，112:13, 1980)，Chee and Pool(Sci.Hort.32:85, 1987)，CLC/Ipomoea (CP) (Chee et al.,J. Am. Soc. Hort.Sci. 117:663, 1992), Chu(N. sub. 6) (Chu et al. ,ScientiaSinic. 18:659, 1975 ；Chu,Proc. Symp.Plant Tiss.Cult. ,Peking 43, 1978), DCR(Gupta and Durzan,Plant Cell Rep. 4:177, 1985), DKff/Juglans (Driver and Kuniyuki,HortScience 19:507， 1984 ;McGranahan et al.,in:Bonga and Durzan，eds.，Cel1 and Tissue Culture in Forestry, MartinusNijhoff,D ordrecht，1987)，De Greef and Jacobs (De Greef and Jacobs，Plant Sci. Lett. 17:55, 1979), Eriksson (ER) (Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gresshoff and Doy (DBM2) (Gresshoff and Doy,Z Pflanzenphysiol.73:132, 1974),Heller 's (Heller, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 11th Ser. 14: 1，1953)，Hoag land's (Ho agland and Arnon，Circular 347,Calif.Agr.Exp.Stat. , Berkeley, 1950),Kao and Michayluk (Kao and Michayluk,Planta 126:105, 1975), Linsmaier and Skoog(Linsmaier and Skoog, Physiol. Plant. 18:100, 1965), Litvay's(LM) (Litvay et al.,Plant Cell Rep. 4:325, 1985)，Nitsch and Nitsch (Nitsch and Nitsch，Science 163:85，1969)，Quoirin and Lepoivre(Quoirin et al. , C. R. Res. Sta. Cult.Fruit Mar. , Gembloux 93, 1977)，Schenk and Hildebrandt(Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bo t.50:199, 1972)，White's(White，The Cultivation of Animal and Plant Cells，Ronald Press，NY，1963)等。
[0177] 根據(jù)一些其它舉例的實施方案，果實細胞和培養(yǎng)基在第一個步驟期間持續(xù)混合。 根據(jù)進一步的實施方案，果實細胞和培養(yǎng)基在第一個步驟期間間歇混合。根據(jù)一些實施方 案，第一個步驟期間的溫度為20 °C -30 根據(jù)一些實施方案，在第一個步驟期間的溫度為 22°C_28°C。根據(jù)一些實施方案，果實細胞在第一個步驟生長多于5天。根據(jù)一些實施方 案，果實細胞在第一個步驟生長多于7天。根據(jù)一些實施方案，果實細胞在第一個步驟生長 多于5天但少于2周。根據(jù)一些實施方案，果實細胞在第一個步驟生長多于5天以上但少 于12天。
[0178] 根據(jù)一些舉例的實施方案，本發(fā)明方法中使用的生物反應(yīng)器包括一個進口，在第 一個步驟果實細胞通過其進入，培養(yǎng)基和任何其它物質(zhì)置于生物反應(yīng)器中。根據(jù)進一步的 實施方案，本發(fā)明方法中使用的生物反應(yīng)器包括排出任何希望的物質(zhì)的出口。根據(jù)一些實 施方案，出口包括玻璃出口，設(shè)計為釋放生物反應(yīng)器中過量的氣體。根據(jù)一些實施方案，氣 體出口是人工操作的。根據(jù)其它的實施方案，氣體出口是自動操作的，其中一旦瓶中的氣 壓（atmosphere)達到預定壓力，貝lj氣體從瓶中釋出。根據(jù)一些實施方案，預定的壓力直至 8PSI〇
[0179] 根據(jù)一些舉例的實施方案，結(jié)束果實細胞生長的第一步之后，將果實細胞接種于 小規(guī)模生物反應(yīng)器中，在此也稱作第一生物反應(yīng)器。對于大規(guī)模方法的第二