直至40天產(chǎn)生500gr/l新鮮生物量。這些 細胞持續(xù)生長及可達到更高生物量。
[0246] 表3 :在大規(guī)模生物反應器（50L)中具有不同水平鹽的不同培養(yǎng)基中生長的RGC 中白藜蘆醇和總多酚的水平
[0247]
[0248] 注意-部分數(shù)值以范圍呈現(xiàn)。
[0249] *括號內(nèi)的數(shù)字描述加入GamborgB5中的礦物質(zhì)的其它濃度
[0250] **數(shù)據(jù)是至少三個實驗的平均數(shù)
[0251] ***數(shù)據(jù)是至少十個實驗的平均數(shù)
[0252]林**McCown，s Woody 植物培養(yǎng)基（Lloyd and McCown, Proc. Int. Plant Prop. Soc. 30:421, 1981
[0253] 實驗3 :在從搖瓶中至大規(guī)模生物反應器中不同生長階段生長的RGC中白藜蘆醇 和總多酚水平的一致
[0254] 如實施例1階段1-4所述將紅葡萄細胞從Erlenmeyer搖瓶至大規(guī)模一次性生物 反應器中在存在補充的GamborgB5中在不同規(guī)模階段生長。
[0255] 表4中的結(jié)果顯示紅葡萄細胞在Erlenmeyer中生長良好及合成高數(shù)量的白藜蘆 醇和總多酚。當細胞在50U300-100L規(guī)模在一次性生物反應器中生長時，與在Erlenmeyer 培養(yǎng)瓶中生長相比獲得更高的生長速度，通過細胞的鮮重和干重揭示，見表4中數(shù)據(jù)所示。 在所有規(guī)格的大規(guī)模生物反應器中，鮮重大于230g/l (表4)，而在Erlenmeyer中為166g/ 1。此外，在大規(guī)模一次性生物反應器中在補充的培養(yǎng)基中總多酚以及白藜蘆醇的水平高于 在Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中獲得的水平，分別為901mg/l和200mg/l (表4)。與由其它人觀測 的結(jié)果不同，這是首次證實果實植物細胞在大規(guī)模一次性生物反應器中的成功生長，具有 高水平的白藜蘆醇和多酚產(chǎn)生。
[0256] 表4 :在搖瓶和不同規(guī)模階段生長的RGC中白藜蘆醇和總多酚水平*
[0257]
[0258] *數(shù)據(jù)是至少三個實驗的平均數(shù)。
[0259] 實驗4 :加入酪蛋白水解物對于在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的紅葡萄細胞 中白藜蘆醇和總多酚水平的影響
[0260] 如實施例1階段3所述將紅葡萄細胞在大規(guī)模一次性生物反應器中在補充的 Gamborg B5 中生長。
[0261] 如表5所示，當在一次性大規(guī)模生物反應器中在有或無酪蛋白水解物的補充的培 養(yǎng)基中生長時，紅葡萄細胞中白藜蘆醇和總多酚的水平相似。
[0262] 表 5
[0263]
[0264] *數(shù)據(jù)是三個實驗的平均數(shù)。
[0265] 實驗5 :加入植物激素對于在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的紅葡萄細胞中白 藜蘆醇和總多酚水平的影響
[0266] 如實施例1階段3所述將紅葡萄細胞在大規(guī)模一次性生物反應器中在補充的 Gamborg B5中生長。如表6所示，當在有或沒有0. 5mg/l NAA和0. 2mg/l激動素的一次性 大規(guī)模生物反應器中生長時，紅葡萄細胞中產(chǎn)生的白藜蘆醇和總多酚水平相似（表6)。
[0267] 表 6
[0268]
[0270] *數(shù)據(jù)是三個實驗的平均數(shù)。
[0271] 實驗6 :蔗糖濃度對于在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的紅葡萄細胞的影響
[0272] 如實施例1階段3所述將紅葡萄細胞在大規(guī)模一次性生物反應器（50L)中在具有 不同鹿糖濃度的補充的Gamborg B5培養(yǎng)基中生長。
[0273] 將紅葡萄細胞在含有2、3、4和6%蔗糖的補充的培養(yǎng)基中生長。如下表6所示，當 細胞在2-4%蔗糖中生長時達到最佳細胞生長和生物量（143-260克/L)。較高的蔗糖濃度 如6%蔗糖抑制細胞生長達10倍（24克/L)。
[0274]表6A
[0275]
[0276] 實驗7:生物反應器構(gòu)造、設計和結(jié)構(gòu)對于在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的 紅葡萄細胞中的白藜蘆醇和總多酚的影響
[0277] 在由滅菌的一次性的透明塑料容器制成的20L生物反應器中評定兩種培養(yǎng) 基-頂1培養(yǎng)基和補充有鎂、磷酸鹽和硝酸鹽的GamborgB5培養(yǎng)基-對于由細胞產(chǎn)生的白 藜蘆醇的量的影響，并與在A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters中公開的數(shù)據(jù)進一 步對比，后者細胞在20L玻璃容器中在頂1培養(yǎng)基中生長。
[0278] 結(jié)果表明在一次性生物反應器中在頂1培養(yǎng)基中生長的紅葡萄細胞產(chǎn)生93mg/l 白藜蘆醇（表7)，其與使用相同培養(yǎng)基（Decendit)在攪動的玻璃生物反應器中產(chǎn)生的水平 高大約3倍。此外，當這些細胞在一次性生物反應器中在補充的GamborgB5中生長時，產(chǎn) 生顯著高水平的白藜蘆醇，為387mg/l(表7)。
[0279] 表7 :生物反應器類型和培養(yǎng)基成分對紅葡萄細胞產(chǎn)生的白藜蘆醇水平的影響
[0280]
[0281] *IM1培養(yǎng)基-Ref?文章 A.Decendit(1996)BiotechnologyLetters
[0282] **數(shù)據(jù)是至少三個實驗的平均數(shù)
[0283] 進一步地，含有補充的Gamborg B5的特定培養(yǎng)基成分與設計一次性生物反應器的 組合誘導細胞產(chǎn)生比在頂1培養(yǎng)基和攪動玻璃生物反應器中產(chǎn)生的水平高10-12倍的白藜 蘆醇，及在一次性生物反應器中在頂1培養(yǎng)基中生長的細胞高4倍（表7)。
[0284] 這些結(jié)果顯示生物反應器類型和培養(yǎng)基成分均為維持在20L或更大生物反應器 中產(chǎn)生的RGC中白藜蘆醇的高水平所必需。
[0285] 實施例3:成分
[0286] 紅葡萄和紫葡萄均含有有效的多酚、抗氧化劑和白藜蘆醇，其有助于防止動脈狹 窄和硬化。越來越多的研究表明在紅葡萄和紫葡萄中及最后在紅葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的白藜蘆醇 影響機體的重要代謝途徑及可有益于健康。然而，其確實具有非常高的糖含量，因此應適度 攝食。
[0287] 在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的紅葡萄細胞的成分是獨特的。
[0288] 除了糖和白藜蘆醇水平之外，所述紅葡萄細胞的化學成分與使用標準農(nóng)業(yè)實踐生 長的葡萄相當。
[0289] 實驗8:與在葡萄園中生長的紅葡萄相比在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的紅 葡萄細胞中的總糖、葡萄糖和果糖水平較低
[0290] 如實施例1階段3和4所述在大規(guī)模一次性生物反應器中在補充的Gamborg B5 中生長的紅葡萄細胞中的總糖、葡萄糖和果糖的量與通過農(nóng)業(yè)方式生長的不同類型紅葡萄 的這些糖的水平相比低25-50倍（表8)。
[0291] 表8;在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的紅葡萄細胞與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的紅葡萄細胞 之間糖水平對比（鮮重）（gr/100gr)
[0292] A.
[0293]
[0296] 樣品1-農(nóng)業(yè)餐桌紅葡萄（以色列）_用于食用的紅葡萄
[0297] 樣品2-釀酒紅葡萄1 (以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的紅葡萄
[0298] 樣品3-釀酒紅葡萄2 (以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的紅葡萄
[0299] 樣品4-釀酒紅葡萄1 (南非）Cabernet-用于制成葡萄酒的紅葡萄
[0300] 實驗9:在大規(guī)模一次性生物反應器中生長的紅葡萄的總多酚和白藜蘆醇成分的 水平
[0301] 除了白藜蘆醇之外，所述紅葡萄細胞中總多酚的水平與田間生長的紅葡萄中的量 相似，前者比后者中白藜蘆醇的水平高40-800倍（表9和10)。如實施例1階段3和4 描述的大規(guī)模一次性生物反應器中生長的5個批次的紅葡萄細胞中的白藜蘆醇的范圍是 726-916mg/kg鮮重，相比之下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的紅葡萄中為0-42. 5mg/kg (表9)。在干燥之后紅 葡萄細胞干粉中白藜蘆醇水平為6000-31000mg/kg粉末（表10)。
[0302] 方法：使用HPLC結(jié)合在280、520和306nm的UV/VIS檢測分析紅葡萄細胞中多酚 和白藜蘆醇的水平。
[0303] 表9 :紅葡萄細胞和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)紅葡萄中酚含量成分（mg/kg鮮重）
[0304]
[0305]
[0306] ND-未檢測到；NT-未測試
[0307] 樣品1-農(nóng)業(yè)餐桌紅葡萄（以色列）_用于食用的紅葡萄
[0308] 樣品2-釀酒紅葡萄1(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的紅葡萄
[0309] 樣品3-釀酒紅葡萄2(以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的紅葡萄
[0310] 樣品4-釀酒紅葡萄1+釀酒紅葡萄2 (以色列）Cabernet-用于制成葡萄酒的紅葡 萄
[0311] 樣品5-釀酒紅葡萄1(南非）Cabernet-用于制成葡萄酒的紅葡萄
[0312] 表10:紅葡萄細胞中白藜蘆醇和總多酚化合物含量
[0313]
[0314](結(jié)果為gr/kg干粉）
[0315] 實施例4:培養(yǎng)的葡萄細胞在體內(nèi)角叉菜膠誘導的足水腫大鼠模型中的作用
[0316] 本項研究的目的在于評估根據(jù)本發(fā)明的大規(guī)模生產(chǎn)方法產(chǎn)生的RGC(紅葡萄細 胞）在大鼠急性炎癥模型中的體內(nèi)抗炎活性，以證實根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的細胞的效力。最廣 泛用于研究急性炎癥的實驗模型之一基于足底內(nèi)施用角叉菜膠。
[0317] 該研究通過兩種方法評定RGC的效力：
[0318] 1?足體積測量
[0319] 2.自由活動的大鼠中炎性疼痛
[0320] 材料和方法：
[0321] 根據(jù)實施例1制備的紅葡萄細胞（RGC)
[0322] 在注射角叉菜膠之前2小時，將RGC作為在無菌飲用水中的懸浮液以400mg/kg體 重（2ml/40mg)的劑量口服。
[0323] RGC組合物：給每只大鼠注射的多酚和白藜蘆醇的量分別為14和4. 8mg(3. 5mg多 酸每100mg RGC，以及1. 2mg白藜蘆醇每100mg RGC)。
[0324] 角叉菜膠誘導的大鼠足水腫：將大鼠分為3組，每組8只大鼠。所有組的大鼠均在 左后足足底注射1%角叉菜膠（0. lmg/足）或無菌鹽水（0. 9% NaCl)。
[0325] 進行如下檢測：
[0326] 足體積測量
[0327] ?在注射角叉菜膠之前0及在注射后1、2、4小時用測徑器按小時測量注射角叉菜 膠的足體積。
[0328] ?以兩個軸測量足直徑并計算足體積。在這個模型中的足水腫是炎癥嚴重度的指 征。
[0329] ?對于每個時間點，通過減去基線足體積或者與基線足體積的百分比計算足體積 的變化。
[0330] 在自由行動的大鼠中測量炎性疼痛的熱板方法
[0331] 使用熱板方法確定自由行動的大鼠中的炎性疼痛。在誘導水腫并用運載體、吲哚 美辛或RGC制備物處理后，將大鼠置于維持55±0. 5°C溫度的熱板上。輕拂或舔舐后足或者 從熱板上跳起的延時與其基線對比，作為反應時間。反應時間標示為在注射后1、2和4小 時。在無反應的情況中，使用30秒截止值以防止組織損害。
[0332] 組分配：
[0333] 運載體對照組（1M):對照大鼠在注射角叉菜膠之前2小時接受無菌飲用水（運載 體）。
[0334] 陽性對照組（"2M"）：陽性對照組的大鼠在注射角叉菜膠之前2小時接受2mg/kg 體重的n引噪美辛。
[0335] 測試組（"3M"）：在注射角叉菜膠之前2小時給大鼠口服施用在無菌飲用水中的 懸浮液 400mg/kg 體重劑量的 RGC(2ml/40mg RGC)。
[0336] 結(jié)果
[0337] 足水腫：
[0338] 圖1顯示用RGC制備物、作為對照的吲哚美辛和水處理的大鼠的足水腫（體積％ ) 的結(jié)果。使用重復測量的雙向AN0VA及隨后的Bonferroni事后檢定進行統(tǒng)計學分析。對 照組（1M)與陽性對照組（2M)的對比在2和4小時顯示統(tǒng)計學顯著差異（p〈0. 001)。對照 組與RGC制備物（3M)組的對比在2和4小時顯示統(tǒng)計學顯著差異（p〈0. 001)。
[0339] 如圖1所示，當用RGC制備物處理大鼠時，在1或2小時后足水腫降低至少為陽性 對照的水平。此外，在4小時后，用RGC制備物處理的大鼠表明足水腫降低甚至比對照組還 低。
[0340] 炎性疼痛
[0341] 圖2顯示在用RGC制備物、用作對照的吲哚美辛和水處理后每組的痛覺過敏作用。 使用重復測量的雙向AN0VA及隨后事后檢定進行統(tǒng)計學分析。對照組1M與陽性對照組2M 的對比在2和4小時顯示統(tǒng)計學顯著差異（p〈0. 05-0. 01)。對照組與RGC(3M)對比在4小 時顯示統(tǒng)計學顯著差異（P〈〇.01)。
[0342] 如在圖2中可見，在注射角叉菜膠2和4小時后，運載體處理的對照組（1M)(接受 無菌飲用水）顯示對熱刺激的反饋時間S (時間）顯著增加。這通過這組中大鼠的足底熱 刺激反應性降低表明。
[0343] 如在圖3中可見，在注射角叉菜膠后2和4小時，與運載體對照組相比陽性對照組 (吲哚美辛處理的大鼠，2M)顯示對熱刺激的反應延時S顯著降低。
[0344] RGC處理的大鼠（3M)顯示在注射角叉菜膠4小時后對熱刺激的反應延時S降低， 與運載體處理的對照組相比有統(tǒng)計學顯著性。
[0345] 綜上所述，這個實施例的結(jié)果表明與角叉菜膠誘導的大鼠后足炎癥相關的足水腫 和行為痛覺過敏通過口服根據(jù)實施例1所述方法制備的RGC而顯著減弱，表示甚至在大規(guī) 模方法中制備的RGC制備物的抗炎作用。這與Gentilli等（2001)描述的使用相同的角叉 菜膠誘導的痛覺過敏模型的研究不同。該研究顯示，在角叉菜膠注射到足里之前給大鼠施 用的高濃度的白藜蘆醇（50mg/kg體重，與本研究中所使用的等價于6mg/kg體重不同）沒 有降低足水腫。
[0346] 實施例5:
[0347] 動物測試
[0348]從 Har 1 an Lab or a t or i e s Lt d.，Jeru sa 1 em，I sr ae 1 獲得 40 只 Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠，體重250 ± 25克。所述大鼠養(yǎng)殖于位于動物房中的普 通籠子內(nèi)，22°C，14小時光照/10小時黑暗的周期。所述大鼠維持標準的大鼠飲食，并 給予自來水隨意飲用，進行為期5天的適應環(huán)境期。適應環(huán)境期之后，所述大鼠換為 由21 %蛋白質(zhì)、5 %脂肪、60 %碳水化合物、0. 49 %鈉和0. 49 %鉀組成的富含果糖的飲食 (Teklad-Harlan, Madison, USA)，并分為四組（每組 10 只大鼠）。
[0349] 所有SD大鼠飼喂高果糖飲食五周。對于部分大鼠（30只大鼠），在飼喂高果糖飲 食三周后，向大鼠飲食直接添加不同劑量（200、400和800mg/Kg/天）的RGC。
[0350] 在基線和飲食三周和五周后測量體重、收縮血壓、血漿甘油三酯、胰島素和脂聯(lián)素 水平，第一和第二次測量是在給30只大鼠補充RGC之前，而第三次測量是五周后，即在補充 RGC時期的兩周后。在研究開始及飲食三周和五周后，20只大鼠（對照組的10只大鼠和補 充400mg RGC的10只大鼠）養(yǎng)殖于代謝籠，以分析尿鈉排泄。
[0351] 血壓測量
[0352] 通過間接尾袖套法測量收縮血壓（BP)，使用電子血壓計和氣動脈搏傳感器 (58500BP Recorder, UGO BASILE, Varese, Italy)。當所述大鼠固定在普通溫度的大鼠夾時 進行所述測量。5次連續(xù)讀數(shù)的平均值用于確定收縮BP。
[0353] 實驗室測量
[0354] 在指示的時間點（第一和第二次測量是在給30只大鼠補充RGC之前，而第三次測 量是起始點五周后，即在補充RGC時期的兩周后）饑餓五小時后，在用異氟烷輕微麻醉下， 通過眼窩后靜脈竇穿刺從所有大鼠采集血液樣品。
[0355] 在存在EDTA的情況下收集用于血漿的血液，以防止凝血，并將血液保持于冰上。 離心后，分離血衆(zhòng)并在-80°C冷凍直至進一步分析。用酶比色反應自動分析儀（Olympus AU 2700, Hamburg, Germany)測定甘油三酯水平。用 I-125RIA試劑盒（INSIK-5, Diasorin, USA) 評估血漿胰島素。用脂聯(lián)素RIA試劑盒（Cat. #MADP-60HK來自Linco Research Inc. ,St. Charles, MO)測量總血衆(zhòng)脂聯(lián)素濃度。用自動分析儀（Olympus An 2700 ;01ympus Diagnostics, Hamburg, Germany)測量尿鈉排泄速率。
[0356] 結(jié)果
[0357] RGC對血壓、血漿甘油三酯、胰島素、脂聯(lián)素和鈉排泄的作用
[0358] 用高果糖飲食飼喂的大鼠補充或不補充RGC體重增加是相似的（表11)。高果糖 飲食誘導了顯著的血壓、血漿甘油三酯、胰島素和脂聯(lián)素水平（圖5,表4)。在高果糖飲食 五周后，收縮 BP 升高 19.1±l.lmm Hg(p〈0.001)，從 137mm Hg 到 156mm Hg。補充 RGC 減 少了由高果糖飲食誘導的BP升高，在接受200mg/Kg/天的RGC的第一組中從161 ±4. 5到 151 ± 3. 6mmHg，在接受400mg/Kg/天的RGC的第二組中從162 ± 5到152 ± 3mmHg以及在接受 8001^/此/天的1?(：的第三組中從162±2.8到150±1.8_取(口〈0.05)。補充1?(：減少了血 漿中的甘油三酯的水平，在接受200mg/Kg/天的RGC的第一組中從234± 14到171± 12mg/ dL，在接受 400mg/Kg/ 天的 RGC 的第二組中從 235± 12 到 167±24mg/dL，在接受 800mg/Kg/ 天的RGC的第三組中從219±31到142±21mg/dL。RGC減少了由高果糖飲食誘導的血漿胰 島素水平，在以200、400和800mg/Kg/天劑量的RGC處理的大鼠組中，從對照組（富含果糖 飲食）的 ±43. 5mg/dL 分別到 33. 9±2. 6、34. 4±3. 8 和 31. 6±2. 9mg/dL。
[0359] 如以下數(shù)據(jù)顯示，RGC對脂聯(lián)素水平?jīng)]有一致的作用，對照組中脂聯(lián)素水平 5. 8±0. 3,與之相比，在以200、400和800mg/Kg/天劑量的RGC處理的大鼠組中，分別為 6. 0+0? 4, 4. 5±0. 2 和 5. 4±0. 5。
[0360] 在補充或不補充RGC的大鼠中，基線尿鈉排泄是相同的（分別為0. 5±0. 1和 0. 7±0. 2mmol/天，p = 0.43)。在高果糖飲食三周后，尿鈉排泄顯著升高，并在補充RGC后 保持不變（三周后，補充或不補充RGC的大鼠中分別為3. 5±0. 2和2. 3±0. 3mmol/天，都 是 p〈0. 05 ;而五周后，分別為 3. 1±0. 2and 1.8±0. 3mmol/天，組間 p = 0. 4)。
[0361] 表11 :所研究的組中的體重、甘油三酯、胰島素和脂聯(lián)素水平
[0362]
[0363]
[0364] *p〈0. 05vs.基線，#p〈0. 05vs.富含果糖飲食
[0365] 實施例6 :RGC-RES的化學性質(zhì)（與其它來源的RES相比）及RGC-RES的人體生物 利用度性質(zhì)
[0366] 材料和方法
[0367] 紅葡萄細胞（RGC)根據(jù)實施例1所述制備。RGC的白藜蘆醇（RES)含量通過HPLC 在306nm針對合成的RES標定曲線確定。
[0368] RGC-RES 的 LC/MS 分析
[0369] 將RGC粉末溶解于80%甲醇中。使用Accela LC系統(tǒng)結(jié)合裝備電噴射離子源的 Linear Trap Quadrupole (LTQ) Orbitrap Discovery hybrid FT 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc.)對樣品進行液態(tài)層析質(zhì)譜分析（LC-MS)。質(zhì)譜儀以負離子化模式運行， 質(zhì)譜在m/z 150-