等分試樣進行 LC-MS/MS 分析。使用具有 SB-C18 Guard Cartridge (12. 5 X 2. 1mm，Zorbax，Agilent，Santa Clara， CA，USA)的 Zorbax SB C18 柱（150X2. lmm，5ym，Zorbax，Agilent，Santa Clara，CA，USA) 進行色譜分析。
[0089] 使用含乙腈（A)和含2mM乙酸銨的0. 2%甲酸⑶的流動相以0. 35ml/分鐘的流量 進行線性梯度洗脫。梯度開始于30 %的洗脫劑A和70 %的洗脫劑B進行3分鐘，并在2分 鐘內(nèi)線性地改變至40 %的洗脫劑B并保持2分鐘。然后在1分鐘內(nèi)將梯度變回至95 %的洗 脫劑B，并保持該百分比6分鐘。分析柱和自動進樣器的溫度都設(shè)定為室溫。然后將所有液 相色譜洗脫劑引入到大氣壓力化學(xué)電離（atmospheric-pressure chemical ionization， APCI)源。質(zhì)譜條件為：氣體1，氮氣（30psi);氣體2,氮氣（30psi);霧化器電流（5.0v); 源溫度，400°C ;幕氣，氮氣（25psi)。對于LGT-E的HPLC色譜圖示于圖2。
[0090] 用于評估LGT-E的CE的細胞系。在實施例中描述了 LGT-E的化學(xué)增敏效應(yīng) 的持續(xù)分析，本文中利用以下的人細胞系：（i)多西他賽抗性的前列腺癌系DU145-TxR 和PC3_TxR(由匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)系和聯(lián)盟醫(yī)療（Partners Healthcare)提供，但在實施 例2-7中使用的PC3-TxR細胞是從密歇根大學(xué)獲得的）；（ii)多西他賽敏感的系PC3和 DU145 (購自 ATCC，Manassas，VA，USA) ; (iii) Herceptill?.敏感性、HER2 陽性乳腺導(dǎo)管癌 系 BT474(由 Cui 博士，Cedars-Sinai，Beverly Hills，CA 提供）；（iv) HerCCptinljt性、 HER2 陽性乳腺癌系 SkBr3(由 Xiaojiang Cui 博士，Cedars-Sinai，Beverly Hills，CA 提 供）；以及（V)分別為柔紅霉素敏感性和抗性的髓性白血病系K562和K562/Dox (由Kenneth Chan博士，俄亥俄州立大學(xué)提供）。
[0091] 實施例2
[0092] LGT-E對于多西他賽抗性前列腺癌細胞系PC3-TrX對多西他賽之增敏作用的劑量 依賴效應(yīng)。通過放置進每個孔中將pc3-t xr細胞接種到有蓋的無菌F-底CellstarK96孔 細胞培養(yǎng)板（目錄號#655180,購自Greiner Bio-one，Monroe，NC)中，向含3000個細胞的 100μ1 RPMI 1640 培養(yǎng)基中補充含 10% 胎牛血清（Thermo Scientific，Logan，UT)和青霉 素溶液（l〇〇U/ml)以及鏈霉素（100 μ g/ml) (Life Technologies Grand Island，NY)。細 胞處于平板接種的52代。為每個所測試的實驗條件分配一式三份的孔，并且對于細胞進行 孔接種允許24小時的恢復(fù)期。在恢復(fù)期期間，在37°C和5% CO2下孵育細胞。
[0093] 通過向DMSO中添加適量的LGT-E粉末以形成500mg/ml的儲備溶液來制備LGT-E。 交替渦旋并超聲處理該儲備溶液直到LGT-E粉末融入溶液。將儲備溶液在RPMI 1640培養(yǎng) 基（Mediatech，Manassas，VA，或者 Life Technologies Grand Island，NY)中稀釋以達到 LGT-E的期望濃度（例如12、25或60 μ g/ml)。
[0094] 用LGT-E預(yù)處理細胞是通過從孔中抽吸培養(yǎng)基，接著加入50 μ 1含12 μ g/ml或 25 μ g/ml濃度之LGT-E溶液的LGT-E溶液并在37°C和5% CO2的條件下孵育細胞兩個小 時。在兩個小時的預(yù)處理期結(jié)束時，在LGT-E培養(yǎng)基存在下，將1 : 3系列稀釋的50 μ 1 等分試樣的多西他賽（其在RPMI 1640培養(yǎng)基中含有IXlO2至1Χ10-3ηΜ的多西他賽 (即，100、33.3、10.0、3.33、1.0、0.333、0.1和0.00111]\〇)加入到預(yù)處理的細胞中。在加 入到細胞之前，立即將來自儲備溶液（105 μM多西他賽于DMSO中，目錄號# :01885,購自 Sigma-Aldrich，St. Louis，M0)的多西他賽稀釋。加入多西他賽之后，在預(yù)處理步驟使用的 相同溫度和大氣壓條件下將細胞再孵育72小時。
[0095] 在72小時的多西他賽處理期后，使用磺酰羅丹明B(SRB)測定以對活細胞進 行定量。從各個孔中吸出介質(zhì)，并用10 %冷的三氯乙酸（TCA)(目錄#:T6399,購自 Sigma-Aldrich)溶液替換，并于4°C下孵育1小時。TCA孵育后，吸出TCA溶液，用自來水 將細胞清洗5次。除去最后一次洗滌液后，將培養(yǎng)板的蓋子打開并留置在室溫下，直到表面 干燥，這將歷時一至兩個小時。然后將50 μ 1的0. 4%磺酰羅丹明B(SRB)鈉鹽（目錄號# : S9012,購自Sigma-Aldrich)溶液加入到每個孔中，將培養(yǎng)板在室溫下孵育20至30分鐘。 之后，用溶于 IOmM TRIS喊（目錄號：161-0719,購自 Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA) 的1%乙酸溶液將孔洗絳5次。隨后將培養(yǎng)板放置以干燥數(shù)小時或過夜。通過向每個孔中 添加100 μ I SRB溶解溶液（IOmM TRIS堿）使得在干燥的孔中殘留的SRB溶解，或者將培 養(yǎng)板放置在輕輕晃動的振動器上或者使培養(yǎng)板在室溫下保持靜止直到SRB溶解，這將歷時 約五到十分鐘。通過酶標儀在565nm吸光度下經(jīng)分光光度測定與固定的活細胞數(shù)目相關(guān)的 各孔中SRB的量。通過比較LGT-E預(yù)處理的細胞和用多西他賽處理而未用LGT-E處理的細 胞來確定細胞生存力的升高或降低。
[0096] 在本實施例中描述的實驗結(jié)果如下：表1和表3報告了關(guān)于用12 μ g/ml和25 μ g/ ml的LGT-E預(yù)處理細胞生存力數(shù)據(jù)；表2和表4報告了通過僅用指定濃度的多西他賽處理 細胞而獲得的對照數(shù)據(jù)。圖3以圖形的形式總結(jié)了表1-4的數(shù)據(jù)。
[0097] 表 1
[0098]
【主權(quán)項】
1. 治療癌癥的方法，其包括以下步驟： 向有此需要的患者施用（a)雷公藤（Tripterygiumwilfordii)的有機溶劑提取物和 (b)化學(xué)治療藥物的組合，其中以有效治療癌癥的組合量施用（a)和（b)，其中所述癌癥至 少部分地對單獨化學(xué)治療藥物（b)的治療有抗性。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述雷公藤的有機溶劑提取物：⑴是乙醇提取物；并 且（ii)可通過如圖2中所描述的MS/LC色譜圖來鑒定。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌、白血病或前列腺癌。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)治療藥物（b)選自：多西他賽、柔紅霉素、曲 妥珠單抗和拉帕替尼。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一部分（a)在施用（b)之前施用。
6. 權(quán)利要求1所述的方法，其中共施用（a)和（b)。 7?權(quán)利要求1所述的方法，其中（a)以使（b)的效力提高到超過（b)單獨施用之效力 的量施用。
8. 化學(xué)治療組合物，其包含： (a)雷公藤的有機溶劑提取物和（b)化學(xué)治療藥物的組合，其中（a)和（b)以有效治療 癌癥的組合量施用；以及 可藥用載體。
9. 權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述雷公藤的有機溶劑提取物：（i)是乙醇提取物； 并且（ii)可通過如圖2中所描述的MS/LC色譜圖來鑒定。
10. 權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述癌癥是乳腺癌、白血病或前列腺癌。
11. 權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述化學(xué)治療藥物（b)選自：多西他賽、柔紅霉素、 曲妥珠單抗和拉帕替尼。
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于克服癌癥治療中的藥物抗性的來自雷公藤(Tripterygium wilfordii)的提取物和組合物。本發(fā)明涉及雷公藤的有機溶劑提取物及其在癌癥治療中的用途，特別是在對化學(xué)治療藥物的治療已經(jīng)表現(xiàn)出抗性的癌癥的治療中的用途。公開了治療癌癥的方法。所述方法向有此需要的患者施用(a)雷公藤的有機溶劑提取物和(b)化學(xué)治療藥物的組合。以有效治療癌癥的組合量施用雷公藤的有機溶劑提取物(a)和化學(xué)治療藥物(b)。被治療的癌癥至少部分地對單獨化學(xué)治療藥物(b)的治療有抗性。還公開了包含(a)雷公藤的有機溶劑提取物和(b)化學(xué)治療藥物的組合以及可藥用載體的化學(xué)治療組合物，其中(a)和(b)以有效治療癌癥的組合量施用。
【IPC分類】A61P37-06, A61P29-00, C07D303-17
【公開號】CN104797296
【申請?zhí)枴緾N201380043906
【發(fā)明人】莫塞斯·辛·薩姆·喬, 黃英, 王競?cè)A, 拉納德希爾·拉武拉, 汪志軍
【申請人】健康科學(xué)西部大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2013年8月19日
【公告號】CA2880575A1, EP2888011A1, US20150238553, WO2014031543A1