利用前列環(huán)素處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞的肺動脈高血壓的治療的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2012年8月1日遞交的第61/678, 208號的美國臨時申請和2013年 1月9日遞交的第61/750, 458號的美國臨時申請的權(quán)益，其內(nèi)容通過全文引用并入文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本申請涉及內(nèi)皮祖細(xì)胞在治療肺動脈高血壓（PAH)和其它類型的肺高血壓的用 途。
【背景技術(shù)】
[0004] 肺動脈高血壓是一種漸進(jìn)性肺部疾病，其在被確診后不進(jìn)行治療會導(dǎo)致平均 在2. 8年內(nèi)死亡。肺循環(huán)增加的收縮導(dǎo)致對右側(cè)心臟增加壓力，這可發(fā)展成為右側(cè)心 臟衰竭。根據(jù)定義，對于慢性肺動脈高血壓，平均肺動脈血壓（mPAP)在靜息狀態(tài)時（at rest)>25mmHg (毫米采柱），或在用力（exertion)期間>30mmHg(正常值<20mmHg)。肺動 脈高血壓的病理生理特征在于肺血管的血管收縮和重塑。在慢性PAH中，存在初始非肌 化（unmuscularized)的肺血管的新肌化（neomuscularization)，以及已經(jīng)肌化血管的血 管肌肉在周長上的增加。這種增加的肺循環(huán)閉塞導(dǎo)致對右側(cè)心臟的漸增的壓力，從而導(dǎo) 致從右側(cè)心臟的輸出降低，最終右側(cè)心臟衰竭（M. Humbert等，J. Am. Coll. Cardiol. 2004， 43,13S-24S)。PAH是一種極為罕見的疾病，具有百萬分之一至二的患病率。這些患者的 平均年齡估計為36歲，只有10%的患者超過60歲。明顯地，比男性更多的女性受到影響 (G. E. D，Alonzo 等，Ann. Intern. Med. 1991，115, 343-349) 〇
[0005] 在市場上有效的標(biāo)準(zhǔn)療法（例如前列環(huán)素類似物、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯 酶抑制劑）能提高生活質(zhì)量、運動耐量和患者的預(yù)后。這些療法的原理主要是影響血管張 力的血液動力學(xué)，但其對致病的重塑過程沒有直接的影響。此外，使用這些藥物的可能性通 過有時嚴(yán)重的副作用和/或復(fù)雜的給藥類型被限制。在通過特定的單藥治療改善或穩(wěn)定患 者的臨床表現(xiàn)的時期是有限的。最終療法升級，從而必須同時給予多個藥物的聯(lián)合療法被 應(yīng)用。盡管在肺動脈高血壓的療法中具有如此進(jìn)步，然而治愈這樣嚴(yán)重的疾病仍沒有前景。
[0006] 內(nèi)皮祖細(xì)胞已經(jīng)在成人骨髓以及外周血和人體臍帶血中被識別，并且已經(jīng)示出了 維持它們的增殖和分化成成熟的內(nèi)皮細(xì)胞的能力（Ashara等，Science 275:964(1997); Murohara 等，J. Clin. Invest. 105 (11) :1527-36 (2000))。在胚胎形成過程中血管生成、 新血管的發(fā)展開始于包括內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC)和造血干細(xì)胞的血島的形成（Risau，Nature 386(6626) :671-4(1997) ;Risau，F(xiàn)ASEB J. 9 (10) :926-33(1995) ;Risau 等，Development 102(3) :471-8(1988) ;Flamme 等，Development 116(2) :435-9(1992) ;Hatzopoulos 等， Development 125(8) :1457-68(1998) ;Doyle 等，Endothelium 13(6) :403-10(2006); Ribatti，Leuk Res. (4) :439-44(2007))〇
[0007] EPC已經(jīng)示出了參與出生后的新血管形成（Takahashi等Nat Med. 5 (4): 434-8(1999) ;Isner和Asahara，J Clin Invest. 103(9) :1231-6(1999))。此外，發(fā)現(xiàn)EPC參 與血管生成、血管修復(fù)和血管保護(hù)（vasculoprotection) (Doyle等，Endothelium 13(6): 403-10(2006))〇
[0008] 現(xiàn)在已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，前列環(huán)素處理的EPC在治療PAH中是有用的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個實施方式是一種用于治療肺動脈高血壓（PAH)的方法，該方法包 括：提供分離的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC);用前列環(huán)素處理EPC，其中處理后的EPC表現(xiàn)出具有增 強血管生成能力的過度增生的表型，以及將包括處理后的EPC的組合物給藥至患有PAH的 對象。在另一個實施方式中，前列環(huán)素可以選自依前列醇鈉、曲前列環(huán)素、伊洛前列素和 PGI2受體激動劑。在另一個實施方式中，對象是人類。在另一個實施方式中，EPC是自體的， 是從患有PAH的對象的血液中分離的，是內(nèi)皮集落形成細(xì)胞，被遺傳性地修飾，和至少一種 生長因子聯(lián)合給藥，和間充質(zhì)干細(xì)胞或已經(jīng)與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸且包含它的一種或多種組 分的培養(yǎng)基聯(lián)合給藥，和/或與前列環(huán)素聯(lián)合給藥。在另一個實施方式中，將EPC與前列環(huán) 素和間充質(zhì)干細(xì)胞或已經(jīng)與間充質(zhì)干細(xì)胞接觸且包含它的一種或多種成分的培養(yǎng)基兩者 聯(lián)合給藥。在另一個實施方式中，生長因子選自FGF、VEGF-A、VEGF-B、BMP-4和TGF-β。在 另一個實施方式中，組合物為藥物組合物，其還包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體或與EPC 不同的至少一種治療劑。在另一個實施方式中，組合物促進(jìn)肺血管修復(fù)。在另一個實施方 式中，在EPC的分離之前，用前列環(huán)素預(yù)處理所述對象。
[0010] 本發(fā)明的另一個實施方式為一種用于促進(jìn)EPC生長的方法，該方法包括：提供分 離的EPC ;用前列環(huán)素處理EPC，其中前列環(huán)素增強EPC的生長。EPC可以從人體或從組織 或細(xì)胞培養(yǎng)中分離。此外，處理后的EPC表現(xiàn)出具有增強血管生成能力的過度增生的表型。 在另一個實施方式中，前列環(huán)素為曲前列環(huán)素。
[0011] 本發(fā)明的另一個實施方式是一種用于治療PAH的方法，該方法包括：提供分離的 EPC ;以及將前列環(huán)素和EPC聯(lián)合給藥至患有PAH的對象。
[0012] 本發(fā)明的另一個實施方式是一種用于治療PAH的方法，該方法包括：提供分離的 EPC ;將EPC給藥至患有PAH的對象；以及將前列環(huán)素給藥至該對象。
[0013] 本發(fā)明的另一個實施方式是一種用于治療PAH的方法，該方法包括：提供分離的 EPC ;將前列環(huán)素給藥至患有PAH的對象；以及將EPC給藥至該對象。
【具體實施方式】
[0014] 除非另有指明，否則"一"或"一個"是指"一個或多個"。
[0015] 除非特別限定，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語應(yīng)被視為具有與本領(lǐng)域 (例如在干細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物 化學(xué)中）的普通技術(shù)人員理解的相同的含義。
[0016] 除非另有說明，否則在本發(fā)明中使用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本 領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法。這種技術(shù)通過文獻(xiàn)來源來描述和解釋，例如J. Perbal， A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley 和 Sons(1984) ;J. Sambrook 等， Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour 實驗室出版社（1989); T. A. Brown (編輯），Essential Molecular Biology :A Practical Approach，第 I 卷和第 2 卷，IRL 出版社（1991) ;D.M· Glover 和 B.D. Hames (編輯），DNA Cloning:A Practical Approach，第 1-4卷，IRL 出版社（1995 年和 1996 年）；以及F. M. Ausubel 等（編輯），Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates和 Wiley-Interscience(1988 年，包括直到目前的所有更新）；Ed Harlow和David Lane(編輯）Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour 實驗室（I988);以及 J.E. Coligan 等（編輯） Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons (包括直到目前的所有更新），并且 其通過引用并入本文。
[0017] 如本文所用，術(shù)語"對象"（在本文也被稱為"患者"）包括溫血動物，優(yōu)選哺乳動 物，包括人。在優(yōu)選的實施方式中，對象為靈長類動物。在一個甚至多個更優(yōu)選的實施方式 中，對象是人。
[0018] 如本文所用的術(shù)語"治療（treating) "、"治療（treat) "或"治療（treatment) "包 括給藥治療有效量的足以減少或消除肺動脈高壓的至少一種癥狀的如本文限定的細(xì)胞。
[0019] 如本文所用的術(shù)語"預(yù)防（preventing) "、"預(yù)防（prevent) "或"預(yù)防 (prevention)"包括給藥治療有效量的足以阻止或阻礙肺動脈高壓的至少一種癥狀的發(fā)展 的如本文限定的細(xì)胞。
[0020] 如本文所用，術(shù)語"干細(xì)胞"是指自我更新的細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生表型和基因型完全 相同的子代以及至少一種其它最終的細(xì)胞類型（例如，末端分化細(xì)胞）。術(shù)語"干細(xì)胞"包括 全能性的（totipotential)、多能性的（pluripotential)和多潛能性的（multipotential) 細(xì)胞、以及源自其分化的祖細(xì)胞和/或前體細(xì)胞。
[0021] 如本文所用，術(shù)語"全能細(xì)胞"或"全能性的細(xì)胞"是指能夠形成完整的胚胎（例 如胚泡）的細(xì)胞。