強(qiáng)度）的量。在相對意義上，這和由細(xì)胞表達(dá)的分子的數(shù)量相關(guān)。
[0048] 流式細(xì)胞儀也可被裝配來測量非熒光參數(shù)，例如細(xì)胞體積或當(dāng)細(xì)胞穿過激光束時(shí) 細(xì)胞散射的光。細(xì)胞體積通常是直接測定。光散射PMT以前向角（前向散射；FSC)或直角 (側(cè)向散射；SSC)來檢測細(xì)胞散射的光。FSC通常是尺寸的指標(biāo)，而SSC是細(xì)胞復(fù)雜度的指 標(biāo)，但是這兩個(gè)參數(shù)都受到其它因素的影響。
[0049] 優(yōu)選地，流式細(xì)胞儀配備有多于一個(gè)的PMT發(fā)射檢測器。附加的PMT可以檢測其 它的發(fā)射波長，允許同時(shí)檢測多于一個(gè)的熒光染料，每個(gè)在各自獨(dú)立的通道中。計(jì)算機(jī)進(jìn)行 分析每個(gè)通道，或每個(gè)參數(shù)與另一個(gè)參數(shù)的相關(guān)性。通常用于FACS儀器的熒光染料包括在 525nm處具有發(fā)射峰（綠色）的異硫氰酸酯（FITC)、在575nm處具有發(fā)射峰（橙紅色）的 R-藻紅蛋白（PE)、在620nm處具有發(fā)射峰（紅色）的碘化丙啶（PI)、在660nm處具有發(fā)射 峰（紅色）的7-氨基放線菌素 D (7-AAD)、在670nm處具有發(fā)射峰（紅色）的R-藻紅蛋白 Cy5(RPE-Cy5)和在655-750nm處具有發(fā)射峰（深紅色）的別藻藍(lán)蛋白（APC)。
[0050] 這些和其它類型的FACS儀器可具有通過使不同性質(zhì)的細(xì)胞偏轉(zhuǎn)進(jìn)入不同的容器 來物理分離各種成分的另外的能力。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明，也可使用任何其它方法用于分離如骨髓、外周血或臍帶血的起始材 料的⑶45+VEGFR+群。本發(fā)明的多種亞群（例如，⑶14+、Tie2+、⑶144-)可以以類似的方 式被分尚。
[0052] 在如上所述的粗細(xì)胞群被純化之前或之后，祖細(xì)胞群可通過本領(lǐng)域中已知的方法 被進(jìn)一步濃縮。例如，祖細(xì)胞可以通過用于EPC的一種或多種抗原特征的陽性選擇被富集。 這種抗原包括例如⑶14或Tie-2。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施方式中，血液直接從供體的循環(huán)外周血中提取。將血液通過含有固相 連接的結(jié)合分子（例如抗體、VEGFR-2)的柱過濾以捕獲EPC。將排除祖細(xì)胞的血液通過本 領(lǐng)域已知的方法（例如血液成分單采技術(shù)）被立即返回到供體的循環(huán)系統(tǒng)。血液以這種方 式被處理直到足夠數(shù)量的祖細(xì)胞結(jié)合到柱上。然后將干細(xì)胞通過本領(lǐng)域中已知的方法從該 柱上分離。該方法允許從非常大量的血液中采集稀有的外周血祖細(xì)胞，減少了供體的費(fèi)用 和采集骨髓的疼痛以及相關(guān)的麻醉、鎮(zhèn)痛、輸血和感染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0054] 使用本文描述的方法將內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并增殖。通過密度梯度離心分離法從 外周血中分離外周血單核細(xì)胞（PBMC)來獲得細(xì)胞。
[0055] 將細(xì)胞懸浮液接種在任何能夠維持細(xì)胞的容器中，特別是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或滾瓶， 尤其在例如25cm2的培養(yǎng)瓶的小培養(yǎng)瓶中。在懸浮液中培養(yǎng)的細(xì)胞以約5X 10 4個(gè)細(xì)胞/ml 至2X IO5個(gè)細(xì)胞/ml (例如，IX 10 5個(gè)細(xì)胞/ml)重新懸浮。將在固定基底上鋪放的細(xì)胞以 約2-3X103個(gè)細(xì)胞/cm 2來放置?？蛇x地，培養(yǎng)板涂覆有如膠原蛋白的基質(zhì)蛋白?？梢詫⒓?xì) 胞放入任何已知的能夠支持細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包括HEM、DMEM、RPMI、F-12等， 包含細(xì)胞代謝所需的補(bǔ)充劑，例如谷氨酰胺和其它氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和例如轉(zhuǎn)鐵蛋白 的蛋白質(zhì)等。該培養(yǎng)基還可以含有抗生素以防止酵母菌、細(xì)菌和真菌的污染，該抗生素例如 青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。培養(yǎng)基可含有源自牛、馬、雞等的血清。
[0056] 培養(yǎng)的條件應(yīng)該接近生理?xiàng)l件。培養(yǎng)基的pH值應(yīng)接近生理pH值（例如，pH值在 6-8之間，在約pH值7至pH值7. 8之間，或pH值7. 4)。生理溫度范圍在約30°C至40°C之 間。EPC在約32°C至約38°C之間的溫度培養(yǎng)（例如，在約35°C至約37°C之間）。
[0057] 可選地，培養(yǎng)基補(bǔ)充有至少一種增殖誘導(dǎo)（"有絲分裂"）的生長因子。"生長因 子"為蛋白質(zhì)、肽或?qū)PC具有生長、增殖誘導(dǎo)、分化誘導(dǎo)或營養(yǎng)作用的其它分子。"增殖誘 導(dǎo)生長因子"是允許EPC增殖的營養(yǎng)因子，包括任何能結(jié)合細(xì)胞表面上的受體而對細(xì)胞發(fā) 揮營養(yǎng)作用或生長誘導(dǎo)作用的分子。增殖誘導(dǎo)生長因子包括EGF、雙調(diào)蛋白、酸性成纖維 細(xì)胞生長因子（aFGF或FGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF或FGF-2)、轉(zhuǎn)化生長因子 a (TGFa )、VEGF以及它們的組合。通常將生長因子添加到培養(yǎng)基中，其濃度范圍約在Ifg/ ml至lmg/ml之間。在約lng/ml至100ng/ml之間的濃度通常是足夠的。能夠容易地進(jìn)行 簡單滴定試驗(yàn)以確定特定的生長因子的最佳濃度。
[0058] 生長因子和營養(yǎng)因子的生物學(xué)效應(yīng)通常通過結(jié)合到細(xì)胞表面受體上來介導(dǎo)。對于 這些因子中一些，受體已被確定，并且對于特定受體的抗體和分子探針可供使用。在分化的 所有階段中EPC可以用于分析生長因子受體的存在。在許多情況下，特定受體的識別對于 添加外源生長因子或營養(yǎng)因子沿特定發(fā)育途徑進(jìn)一步分化細(xì)胞的使用策略提供了指導(dǎo)。
[0059] -般地，在體外約3-10天后，EPC的培養(yǎng)基通過吸出培養(yǎng)基并將新鮮培養(yǎng)基加入 到培養(yǎng)瓶中來重新補(bǔ)充?？蛇x地，將吸出的培養(yǎng)基收集、過濾，并用作用于隨后傳代EPC的 條件培養(yǎng)基。例如使用10 %、20%、30%、40 %或更多的條件培養(yǎng)基。
[0060] EPC細(xì)胞培養(yǎng)可以很容易地傳代，以重新開始擴(kuò)增。例如，在體外3-7天后，將培養(yǎng) 瓶充分搖勻，然后將EPC轉(zhuǎn)移到50ml離心管中并且低速離心。將培養(yǎng)基吸出，將EPC再懸 浮于少量的培養(yǎng)基中。然后將細(xì)胞計(jì)數(shù)并以所期望的密度重新鋪板，以重新開始增殖。這 個(gè)過程可以每周重復(fù)，導(dǎo)致每代活細(xì)胞的數(shù)目以對數(shù)增加。該過程繼續(xù)進(jìn)行直到獲得期望 數(shù)量的EPC。
[0061] EPC和EPC子代可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行冷凍保存直至需要它們。（參 見，例如，美國專利第 5071741 號，PCT 國際專利申請 W093/14191、W095/07611、W096/27287、 W096/29862 和 W098/14058, Karlsson 等，65 Biophysical J.2524-2536(1993))?？梢詫?EPC懸浮在含有特定冷凍保存劑的等滲溶液中，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)基。這種冷凍保存劑包括二甲 基亞砜（DMSO)、甘油等。這些冷凍保存劑以5-15% (例如，8-10%)的濃度被使用。細(xì)胞 被逐漸冷凍到-KTC至-150°C的溫度（例如，-20°C至-100°C、或-70°C至-80°C )。
[0062] 用前列環(huán)素處理EPC
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，前列環(huán)素被用于處理分離的EPC。本文所用的術(shù)語"前列 環(huán)素"明確包括任何前列腺素 I2 (PGI2)、任何前列環(huán)素類似物、以及任何PGI2受體激動(dòng)劑。 例子包括依前列醇鈉（例如Flolan? )、曲前列環(huán)素（例如TYVASO?、Remodulin? )、伊洛前列素（例如Ventavis? )和PGI2受體激動(dòng)劑（例如Selexipag)。
[0064] 相比于未處理的EPC，用前列環(huán)素處理的EPC表現(xiàn)出具有增強(qiáng)血管生成性質(zhì)的過 度增生的表型，這在治療PAH中是有利的。
[0065] EPC可以用前列環(huán)素以各種方式來處理。例如，在EPC的擴(kuò)增過程中可以使用前列 環(huán)素處理離體的EPC ;可以將前列環(huán)素和EPC聯(lián)合給藥至接受者；也可以在移植后用前列環(huán) 素處理EPC。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，EPC可以從接受者自己的血液或骨髓中來制備。 在這種情況下，前列環(huán)素也可以在EPC從接受者中分離之前用于處理EPC。
[0066] EPC的給藥
[0067] 通過給藥 / 移植 EPC 治療 PAH 在 Wang 等，J. Am. Coll. Cardiol. 49 : 1566-1571 (2007)，Zhao 等，Circ. Res. 96 :442-450 (2005)，以及 Nagaya 等，Circulation 108 :889-895(2003)中被描述，其內(nèi)容通過全文引用并入本文。
[0068] EPC進(jìn)入受損血管的給藥/移植具有修復(fù)受損血管組織（例如，靜脈、動(dòng)脈、毛細(xì) 血管）的潛能，從而恢復(fù)血管功能。然而，為了移植目的，合適的細(xì)胞缺乏已阻止了這個(gè)過 程的全部潛能被滿足。"合適的"細(xì)胞是滿足以下一個(gè)或多個(gè)條件的細(xì)胞：（1)可大量獲得； (2)可以在體外增殖，如果需要的話，則允許遺傳物質(zhì)的插入；（3)能夠無限期地生存，并促 進(jìn)對移植r的血管修復(fù)；和（4)無免疫原性，優(yōu)選從患者自身的組織或從相容的供體中獲 得。合適的EPC可以是自體的、異體的或異種的。
[0069] 可以將EPC給藥于患有異常脈管系統(tǒng)或冠狀動(dòng)脈衰竭癥狀的對象。EPC可從接受 者自己的血液或骨髓中來制備。在這種例子中，EPC可以從離解的組織中產(chǎn)生，并使用上述 方法在體外增殖。當(dāng)擴(kuò)增合適的細(xì)胞數(shù)量時(shí)，可采集EPC，如果需要遺傳修飾，則準(zhǔn)備用于直 接注射到接受者的脈管系統(tǒng)。
[0070] EPC可以從對于宿主異種的供體組織制備。為了使異種移植順利，通常采用減少 或消除對移植的組織的免疫反應(yīng)的一些方法。因此，EPC接受者可通過使用免疫抑制藥物 (例如環(huán)孢菌素）或通過局部免疫抑制策略（采用局部應(yīng)用的免疫抑制劑）進(jìn)行免疫抑制。 Gruber，54Transplantation 1-11(1992)公開局部免疫。美國專利第5026365號公開了適 用于局部免疫抑制的封裝方法。
[0071] 作為使用免疫抑制技術(shù)的可替選方案，被Smithies等，317Nature 230-234(1985) 教導(dǎo)的在胚胎干細(xì)胞中利用同源重組的基因置換或基因敲除的方法，并擴(kuò)展到在細(xì)胞系中 基因置換或基因敲除的方法（Zheng等，88Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)