>[0022] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"多能細(xì)胞"或"多能性的細(xì)胞"是指具有完全分化的多功能性 (即成長(zhǎng)為任何哺乳動(dòng)物體的約260種細(xì)胞類型的能力）的細(xì)胞。多能細(xì)胞可以自我更新， 并能在組織內(nèi)保持休眠或靜態(tài)。
[0023] 所謂"多潛能性的細(xì)胞"或"多潛能細(xì)胞"是指能夠產(chǎn)生任何幾種成熟細(xì)胞類型的 細(xì)胞。如本文所用，這個(gè)短語(yǔ)包含了成年的或胚胎的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，以及這些細(xì)胞的多潛 能性的后代。與多能細(xì)胞不同，多潛能細(xì)胞不具有形成所有細(xì)胞類型的能力。
[0024] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"祖細(xì)胞"是指致力于分化成特定類型的細(xì)胞或形成特定類型的 組織的細(xì)胞。
[0025] 內(nèi)皮祖細(xì)胞
[0026] 本發(fā)明提供了 EPC。EPC是一種可被誘導(dǎo)增殖的未分化細(xì)胞。EPC能夠自我維持， 使得隨著每次細(xì)胞分裂，至少一個(gè)子細(xì)胞也將是EPC細(xì)胞。EPC能夠被擴(kuò)增100倍、250倍、 500 倍、1000 倍、2000 倍、3000 倍、4000 倍、5000 或更多倍。
[0027] EPC的表型顯示，這些細(xì)胞表達(dá)定向的造血標(biāo)記⑶45。此外，對(duì)VEGFR-2和/或 Tie-2, EPC可以是免疫反應(yīng)性的?？蛇x地，對(duì)于⑶14, EPC是免疫反應(yīng)的。EPC是多潛能祖 細(xì)胞。
[0028] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)通過(guò)特定的酪氨酸激酶受體來(lái)作用，該酪氨酸激酶受 體包括 VEGFR-I (f It-Ι)和 VEGFR-2 (flk-1/KDR)和 VEGFR-3/FU-4,該酪氨酸激酶受體傳 遞信號(hào)，該信號(hào)對(duì)于胚胎血管生成和造血作用是必不可少的。盡管VEGF結(jié)合所有三種受 體，但是大多數(shù)生物學(xué)功能通過(guò)VEGFR-2介導(dǎo)，而VEGFR-I的作用目前還是未知的。已知 VEGFR3/FU4信號(hào)對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的形成是重要的，VEGFR3信號(hào)可以將淋巴管類內(nèi)皮樣 表型給予內(nèi)皮細(xì)胞。VEGFR傳遞（relay)信號(hào)用于在刺激血管生長(zhǎng)、血管舒張、誘導(dǎo)血管滲 透性、內(nèi)皮細(xì)胞迀移、增殖和存活中必不可少的過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)所有不同的VEGF-R。在 胚胎發(fā)育期間，已經(jīng)報(bào)道單個(gè)祖細(xì)胞、造血細(xì)胞可以產(chǎn)生造血系統(tǒng)和血管系統(tǒng)兩者。
[0029] Tie-2是內(nèi)皮特有的受體酪氨酸激酶和用于血管生成素1的受體。它是I型膜蛋 白質(zhì)，其主要表達(dá)在活躍生長(zhǎng)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中，并且可以代表最早的哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞 系標(biāo)記。Tie-2很可能參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)，并且可以在血管形成期間引導(dǎo)內(nèi)皮 細(xì)胞的特定取向。
[0030] CD14抗原是用于脂多糖（LPS)和LPS結(jié)合蛋白質(zhì)（LBP)復(fù)合物的高親和性受體。 ⑶14抗原是包括⑶14、TLR4和MD-2的功能性異源LPS受體復(fù)合物的一部分。⑶14在外周 血、其它體液和各種組織（如淋巴結(jié)和脾臟）中的大多數(shù)人體單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上強(qiáng)烈 表達(dá)。CD14在人體中性粒細(xì)胞和髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞的亞群上弱表達(dá)。
[0031] ⑶45抗原是酪氨酸磷酸酶，也被稱為白細(xì)胞共同抗原（LCA)。⑶45存在于造血來(lái) 源的除了紅細(xì)胞、血小板和它們的前體細(xì)胞之外的人體細(xì)胞。CD45分子對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞 的活化是必需的并且根據(jù)細(xì)胞的活化狀態(tài)以至少5個(gè)亞型表達(dá)。
[0032] VEGFR-1+、VEGFR-2+和Ti e-2+細(xì)胞分別構(gòu)成血液中的單核細(xì)胞的總?cè)旱拇蠹s 3. 0· +-· (λ 2%、0· 8. +' (λ 5%、2· 0· +' 0· 3%QCD14+/VEGFR-2+細(xì)胞構(gòu)成單核細(xì)胞的總?cè)旱?約2. 0. +-. 0. 5%和血液中單核細(xì)胞的總?cè)旱?. 08. +-. 0. 04%。
[0033] EPC可以在體外保持長(zhǎng)期培養(yǎng)。EPC能夠被傳代培養(yǎng)2次、3次、4次、5次、6次、7 次、8次、9次、10次、11次、12次或更多次。
[0034] PC包括內(nèi)皮集落形成細(xì)胞，通常在1-3周的細(xì)胞培養(yǎng)后形成。根據(jù)Smardja等， Angiogenesis 14(1) :17-27(2011)，內(nèi)皮集落形成細(xì)胞具有定向內(nèi)皮譜系的前體細(xì)胞的特 性，并且能夠合并成到新生血管中。
[0035] EPC的分尚和培養(yǎng)
[0036] EPC 的分離、純化、離體培養(yǎng)和特征在 Hill 等，N.Engl. J. Med :593-600(2003); Assmus 等，Circulation 106:3009-16(2002);王等，J. Am. Coll. Cardiol. 4949: 1566-71(2007);和Kalka等，P. N. A. S. 97 :3422-7(2000)中被描述，其內(nèi)容通過(guò)整體引用并 入本文。此外，內(nèi)皮集落形成細(xì)胞的分離、純化、離體培養(yǎng)和特征在Yoder等，Blood 109 : 1801-1809(2007) ;Ingram 等，Blood 104:2752-2760(2004)和 Smardja 等，Angiogenesis 14(1) :17-27(2011)中被描述，其內(nèi)容通過(guò)全文引用并入本文。
[0037] 例如，細(xì)胞群通過(guò)陽(yáng)性選擇或通過(guò)陽(yáng)性選擇和陰性選擇兩者以任一次序的混合而 分離。將祖細(xì)胞群純化。純化的EPC群比從該細(xì)胞中分離的粗細(xì)胞群含有顯著更高比例的 EPC0
[0038] 例如，相對(duì)于總?cè)海兓^(guò)程應(yīng)導(dǎo)致ECP至少5倍增加，優(yōu)選至少10倍增加，更優(yōu) 選至少15倍增加，最優(yōu)選至少20倍增加，最佳至少25倍增加。純化的EPC群應(yīng)該包括至 少15 %的EPC，優(yōu)選至少20 %的EPC，更優(yōu)選至少25 %的EPC，最優(yōu)選至少35 %的EPC，最佳 至少50 %的EPC。
[0039] 本文描述的方法可以導(dǎo)致包括高達(dá)75%的干細(xì)胞、優(yōu)選至多80%的干細(xì)胞、更優(yōu) 選高達(dá)85%的干細(xì)胞、最優(yōu)選高達(dá)90%的干細(xì)胞、最佳高達(dá)95%的干細(xì)胞的混合物。這樣 的方法能夠生產(chǎn)包括99%的EPC、99. 90%的EPC、甚至100%的EPC的混合物。因此，如上 所述，本發(fā)明的純化群比那些天然存在的含有顯著更高含量的EPC。
[0040] 純化的EPC群可以通過(guò)將含有表達(dá)EPC的抗原特性的干細(xì)胞群的細(xì)胞的粗混合物 與特異性結(jié)合至抗原的細(xì)胞外部分的分子接觸來(lái)分離。這樣的技術(shù)被稱為陽(yáng)性選擇。EPC 結(jié)合至分子允許EPC充分地區(qū)別于不表達(dá)抗原的污染細(xì)胞，以允許從污染細(xì)胞中分離干細(xì) 胞?？乖瓋?yōu)選為VEGFR，更優(yōu)選為VEGFR-2。
[0041] 用于從污染細(xì)胞中分離祖細(xì)胞的分子可以是任何特異性結(jié)合至表現(xiàn)EPC的抗原 的分子。該分子可以是，例如單克隆抗體、單克隆抗體的片段，或者，對(duì)于抗原是受體的情 況，該分子可以是該受體的配體。例如，對(duì)于VEGF受體、如FLK-I而言，配體是VEGF。
[0042] 本公開(kāi)內(nèi)容的獨(dú)特分離的細(xì)胞可以憑借它們的CD45+狀態(tài)和占有血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子受體（VEGFR)(例如VEGFR-2)而與其它細(xì)胞分開(kāi)。細(xì)胞可以通過(guò)常規(guī)分開(kāi)細(xì)胞的技術(shù) 來(lái)進(jìn)行分離，該技術(shù)例如在Civin的美國(guó)專利第4714680號(hào)、第4965204號(hào)、第5035994號(hào) 和第5130144號(hào)、Tsukamoto等的美國(guó)專利第5750397號(hào)和Loken等的美國(guó)專利第5137809 號(hào)中描述的那些技術(shù)，其分別通過(guò)全文引用并入本文。因此，例如，CD45特異性單克隆抗體 或VEGFR特異性抗體可以被固定在固體載體如硝酸纖維素、瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纖 維膜、磁珠和塑料培養(yǎng)皿上。然后可以將整個(gè)細(xì)胞群通過(guò)固體載體被傳代或添加到珠上。
[0043] 被結(jié)合至結(jié)合分子的細(xì)胞可以通過(guò)從使固體載體與剩余的細(xì)胞懸浮液物理分離 而從該細(xì)胞懸浮液中去除。例如，在允許足夠的時(shí)間使固體載體結(jié)合至干細(xì)胞之后，可以將 未結(jié)合的細(xì)胞用生理緩沖液洗脫或洗掉。
[0044] 主要根據(jù)固相和結(jié)合分子的性質(zhì)，通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔Y(jié)合的細(xì)胞與固相分 開(kāi)。例如，通過(guò)劇烈攪拌將結(jié)合的細(xì)胞從塑料培養(yǎng)皿中洗脫?？商孢x地，結(jié)合的細(xì)胞可通過(guò) 酶"切割"或消化在固相和抗體之間的酶敏感的"間隔區(qū)"序列而被洗脫。與瓊脂糖珠結(jié)合 的合適的間隔區(qū)序列可從例如Pharmacia購(gòu)買到。
[0045] 然后將洗脫的富集的細(xì)胞部分用緩沖液通過(guò)離心分離洗滌，并且根據(jù)常規(guī)技術(shù)以 活的狀態(tài)在低溫下保存供以后使用。也可以將細(xì)胞通過(guò)例如靜脈輸注到接受者而立即使 用。
[0046] 保持附接至固體載體的那些細(xì)胞是含有標(biāo)記的細(xì)胞，該標(biāo)記通過(guò)所用抗體來(lái)識(shí) 另IJ。因此，如果使用抗CD45抗體，然后所得的群將大大富集CD45+細(xì)胞。如果所用的抗體 是VFGFR，然后所得的群將大大富集VEGFR+細(xì)胞。然后該群可以通過(guò)重復(fù)使用具有與之附 接的抗體的固相而富集其它標(biāo)記，該抗體用于所述其它標(biāo)記。
[0047] 另一種分選⑶45+、VEGFR+細(xì)胞的方法是通過(guò)流式細(xì)胞儀，最優(yōu)選地通過(guò)熒光激 活細(xì)胞分選儀（FACS)，例如由Becton-Dickinson以名稱FACScan或FACSCalibur制造的 那些。通過(guò)這種技術(shù)，在其上具有⑶45標(biāo)記的細(xì)胞通過(guò)抗-⑶45抗體而標(biāo)記特定的熒光染 料，該抗體已經(jīng)和這種染料共軛。同樣地，細(xì)胞的VEGFR標(biāo)記通過(guò)抗VEGFR抗體而標(biāo)記不同 的熒光染料，該抗體和其它染料共軛。當(dāng)將染色的細(xì)胞放置在儀器上時(shí)，細(xì)胞流被引導(dǎo)通過(guò) 激發(fā)熒光染料發(fā)光的氬激光束。這種發(fā)出的光通過(guò)一組光學(xué)濾波器由光電倍增管（PMT)進(jìn) 行檢測(cè)，該光電倍增管專用于熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)。通過(guò)PMT檢測(cè)到的信號(hào)在其自己的信 道中被放大，并通過(guò)計(jì)算機(jī)以多種不同的形式來(lái)顯示一例如，直方圖、點(diǎn)顯示或者輪廓顯 示。因此，以一個(gè)波長(zhǎng)發(fā)射的熒光細(xì)胞表達(dá)與特定熒光染料標(biāo)記的試劑起反應(yīng)的分子，而非 焚光的細(xì)胞或在不同波長(zhǎng)處發(fā)射的焚光細(xì)胞不表達(dá)該分子，但可表達(dá)與在其他波長(zhǎng)下發(fā)焚 光的熒光染料標(biāo)記的試劑起反應(yīng)的分子。流式細(xì)胞儀也是半定量的，因?yàn)樗@示由細(xì)胞表 達(dá)的熒光（熒光