1:6?1:8。
[0058]優(yōu)選的，上述制備方法中，所述超聲處理的條件為:功率30-60W，每隔5-10s關(guān)閉
5-10s，共處理 l-2min。
[0059]優(yōu)選的，上述制備方法，其中聚乙烯醇的濃度為2-4% (w/v)。
[0060]本發(fā)明還提供上述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜的制備方法，包括下述步驟:
[0061](I)去細(xì)胞瓣膜和巰基化試劑N-丁二酸-S-乙酰基巰基乙二醇酯發(fā)生巰基化反應(yīng)后，用鹽酸羥胺對所生成的乙酰化巰基進(jìn)行保護(hù)，得到巰基化的去細(xì)胞瓣膜；
[0062](2)將步驟(I)所述巰基化的去細(xì)胞瓣膜與任一上述納米材料混合，反應(yīng)后得到所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜。
[0063]優(yōu)選的，上述制備方法中，所述巰基化反應(yīng)的溫度為35_40°C，所述步驟(2)的反應(yīng)溫度為35-40 °C。
[0064]本發(fā)明還提供上述任一納米材料或任一可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜在心臟瓣膜器材中的應(yīng)用。
[0065]本發(fā)明所取得的有益效果:
[0066](I)本發(fā)明所制備的新型可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜，將外源性生物信號VEGF引入到去細(xì)胞瓣支架材料上，可加速去細(xì)胞瓣的內(nèi)皮化，從而改善瓣膜支架材料的相關(guān)生物學(xué)性能，有望能克服當(dāng)前生物瓣膜的一些不足。
[0067](2)利用VEGF對內(nèi)皮祖細(xì)胞具有強(qiáng)烈的招募作用，使內(nèi)皮祖細(xì)胞在去細(xì)胞瓣膜局部定植、生長、分化，加速去細(xì)胞瓣的內(nèi)皮化，使去細(xì)胞基質(zhì)與血漿成分相隔開，防止鈣化位點(diǎn)和膠原纖維的暴露，最終防止或延緩瓣膜支架材料的鈣化和血小板的激活。
[0068](3)所制備載血管內(nèi)皮生長因子的納米粒，屬于納米控釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)對VEGF165的包封率高，所制備的納米粒呈球形，表面光滑，形態(tài)規(guī)整，粒徑分布均勻，穩(wěn)定性好。體外累計釋放速度較緩慢，未見明顯的突釋效應(yīng)，達(dá)到了緩慢控制釋放的效果。細(xì)胞毒性實驗提示納米粒對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無毒性作用。
[0069](4)本納米控釋系統(tǒng)將VEGF165包封在納米材料中，既不影響生物信號分子活性，又能對其有效地保護(hù)，使其免遭化學(xué)和酶降解以及體內(nèi)高速血流剪切力的破壞。且該納米控釋系統(tǒng)能通過控制PCL的分子量及投料量很好的控制VEGF165的釋放速度和釋放周期，從而使去細(xì)胞瓣處維持一定濃度的VEGF。
[0070](5)構(gòu)成載體材料的MAL-PEG-PCL和PCL均為可降解材料，可在體內(nèi)生物酶的作用下完全降解，且降解產(chǎn)物及其代謝產(chǎn)物對人體無毒害，具有良好的生物降解性和相容性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0071](6)利用MAL-PEG-PCL共聚物修飾的PCL納米粒包封生物信號分子VEGF165，形成可控釋的載VEGF165的PCL納米粒，再通過MAL-PEG末端馬來酰亞胺中不飽和的碳碳雙鍵與引入到去細(xì)胞瓣膠原蛋白上的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，最終將納米粒連接到去細(xì)胞瓣膜上。本發(fā)明通過掃描電子顯微鏡觀察、紅外光譜檢測及熒光分子替代實驗均顯示納米粒子共價結(jié)合到巰基化的去細(xì)胞瓣膜上，成功制備出具有可控釋放VEGF的新型去細(xì)胞瓣膜。
[0072](7)將納米控釋系統(tǒng)和組織工程技術(shù)共同應(yīng)用于組織工程心臟瓣膜的構(gòu)建研宄，加速去細(xì)胞瓣的內(nèi)皮化，為組織工程心臟瓣膜支架材料的改性修飾研宄提供一種新方法。
【附圖說明】
[0073]圖1為實施例一所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的納米材料的制備過程示意圖。
[0074]圖2為實施例一所述MAL-PEG和MAL-PEG-PCL共聚物的紅外光譜圖，其中，A為MAL-PEG的紅外光譜圖，B為MAL-PEG-PCL共聚物的紅外光譜圖。
[0075]圖3為實施例一所述為MAL-PEG-PCL共聚物的核磁共振氫譜圖，其中，a處質(zhì)子峰δ = 1.38，b 處 δ = 1.65，c 處 δ = 2.31，d 處 δ = 3.64，e 處 δ = 4.06，f 處 δ =6.74，g 處 δ = 4.23，h 處 δ = 3.84。
[0076]圖4為實施例一所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子納米材料透射電子顯微鏡圖。
[0077]圖5為實施例一所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子納米材料的粒徑分布圖。
[0078]圖6為實施例一所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子納米材料的Zeta電位圖。
[0079]圖7為實施例一所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子納米材料體外累計釋放曲線。
[0080]圖8為實施例一所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子納米材料在不同濃度硫酸鈉溶液中的吸光度。
[0081]圖9_a和圖9_b分別為實施例一所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子去細(xì)胞辧膜和單純?nèi)ゼ?xì)胞瓣的掃描電子顯微鏡圖。
[0082]圖10為實施例一所述各瓣膜的紅外光譜圖，其中，A為單純?nèi)ゼ?xì)胞瓣的紅外光譜圖，B為未載血管內(nèi)皮生長因子復(fù)合瓣膜的紅外光譜圖，C為載血管內(nèi)皮生長因子復(fù)合瓣膜的紅外光譜圖。
[0083]圖ΙΙ-a為對比例中經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載香豆素_6的復(fù)合瓣膜熒光顯微鏡圖。
[0084]圖ΙΙ-b為對比例中經(jīng)M-PEG-PCL修飾的載香豆素_6的復(fù)合瓣膜熒光顯微鏡圖。
【具體實施方式】
[0085]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中所用去細(xì)胞基質(zhì)表面沒有完整的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，可能會引起組織鈣化和衰敗，且由于去細(xì)胞基質(zhì)表面膠原纖維的暴露，在體內(nèi)可能激活血小板而導(dǎo)致血栓等問題，本發(fā)明提供了一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜及其制備方法。
[0086]一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所述去細(xì)胞瓣膜的制備方法包括下述步驟:
[0087](l)MAL-PEG-PCL 的合成
[0088]采用開環(huán)聚合法，分別稱取一定量經(jīng)干燥處理的MAL-PEG和ε -CL置于干燥的25ml三口圓底燒瓶中，以辛酸亞錫為催化劑，甲苯為反應(yīng)溶劑，反復(fù)抽真空充氮?dú)?次，使反應(yīng)在氮?dú)猸h(huán)境中進(jìn)行。68°C油浴加熱磁力攪拌下，開環(huán)聚合合成MAL-PEG-PCL。經(jīng)72小時反應(yīng)后，關(guān)閉油浴鍋電源，待反應(yīng)系統(tǒng)冷卻至室溫關(guān)閉氮?dú)?，得到MAL-PEG-PCL粗產(chǎn)物。68°C條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時以除去產(chǎn)物中剩余的甲苯，冷卻至室溫后，加入一定量二氯甲烷使反應(yīng)產(chǎn)物完全溶解，之后用乙醚對其進(jìn)行沉淀，4°C靜置，之后在減壓條件下抽濾，得白色沉淀物。將其再次溶于二氯甲烷，乙醚對其進(jìn)行沉淀，4°C靜置，減壓條件下抽濾，得到白色產(chǎn)物，于_20°C保存，備用。
[0089](2)VEGF165_磷脂復(fù)合物的制備
[0090]先精確稱取一定量的大豆磷脂于干燥的西林瓶中，再加入一定量的叔丁醇，充分吹打混勻，使磷脂完全溶解。將VEGF165溶于三蒸水中，最后將磷脂/叔丁醇溶液與VEGF165水溶液混合，充分吹打混勻，在冷凍干燥機(jī)_56°C條件下預(yù)凍3小時，再經(jīng)真空干燥20小時，封口密封于_20°C保存。
[0091]此外，本發(fā)明不限制VEGF165-磷脂復(fù)合物的來源，商購得到的VEGF165-磷脂復(fù)合物也適用于本發(fā)明。
[0092](3)可控釋VEGF165的PCL納米粒的制備
[0093]參照復(fù)合納米粒的制備路線(見圖1)，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復(fù)合物的PCL納米粒。首先制備Ο/W型乳劑，油相為含上述凍干的VEGF165-磷脂復(fù)合物、PCL、MAL-PEG-PCL、二氯甲烷的溶液，而水相為聚乙烯醇(PVA)水溶液。將油相加入水相后立即超聲處理一定時間。然后于常溫下低速磁力攪拌4.5小時以揮去二氯甲烷，滴加I % Triton X-100溶液，再攪拌30分鐘以破壞未被載入PCL納米粒的磷脂月父團(tuán)。最終制得納米?；鞈乙骸?br>[0094](4)去細(xì)胞瓣的制備及巰基化
[0095]豬主動脈瓣的獲取:清潔條件下獲取豬心臟，4°C生理鹽水沖洗心臟以去除血污，暴露主動脈根部，剪斷附近的心肌、腱索等并取出含瓣葉的主動脈根部，4°C生理鹽水反復(fù)沖洗，置于4°C含抗生素的生理鹽水中帶回實驗室。在實驗室環(huán)境下裁剪主動脈瓣葉，磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，置于4°C含抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0096]去細(xì)胞瓣的制備(參考文獻(xiàn):董念國等，組織工程瓣膜天然支架去細(xì)胞方法的比較.中華實驗外科雜志，2005.22(3):第377頁.):將獲取的瓣膜置于37°C含0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA的磷酸鹽緩沖液中12小時，再置于4°C含1% Triton X-100的去細(xì)胞液中48小時，磷酸鹽緩沖液沖洗后，置于37°C含核酸酶(脫氧核糖核酸酶200mg/L、核糖核酸酶20mg/L)的磷酸鹽緩沖液處理I小時，最后用磷酸鹽緩沖液清洗，去細(xì)胞瓣完成制備。
[0097]巰基化去細(xì)胞瓣的制備:將制備好的去細(xì)胞瓣與巰基化試劑N- 丁二酸-S-乙?；鶐€基乙二醇酯于一定溫度下反應(yīng)2小時，磷酸鹽緩沖液洗脫終止反應(yīng)后，用鹽酸羥胺對乙?；瘞€基去保護(hù)，磷酸鹽緩沖液洗去殘余鹽酸羥胺，制得巰基化的去細(xì)胞瓣。
[0098](5)可控釋VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜的制備
[0099]將巰基化的去細(xì)胞瓣浸沒于稀釋一定比例的經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復(fù)合物的PCL納米?；鞈乙褐?，在37°C、75rpm恒溫振蕩器上持續(xù)振蕩8小時，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，之后用磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合到瓣膜上的納米粒，共3次，每次5分鐘，最終制得可控釋VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜。
[0100]另一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所述的可控釋放血管內(nèi)皮生長因子納米材料的合成路線如圖1所示:取含羥基末端的MAL-PEG與ε -CL在催化劑辛酸亞錫作用下，于68°C反應(yīng)72小時，利用開環(huán)聚合法制備得到MAL-PEG-PCL聚合物；以MAL-PEG-PCL、PCL、VEGF-磷脂混合和二氯甲烷為油相，以PVA溶液為水相，在常溫超聲作用下，制備所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子納米材料。
[0101]下面通過具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜及其制備方法。
[0102]在下面的實施例中，所用的各試劑和設(shè)備信息如下:
[0103]1.試劑信息
[0104]馬來酰亞胺-聚乙二醇:MAL-PEG購于北京鍵凱科技有限公司；
[0105]甲氧基聚乙二醇:M-PEG購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號202509 ；
[0106]ε -己內(nèi)酉旨:ε -CL購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號704067 ；
[0107]辛酸亞錫購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號S3252 ；
[0108]叔丁醇購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號471712 ；
[0109]聚己內(nèi)酯:PCL購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號440752 ；
[0110]聚乙二醇辛基苯基醚:Triton X-100購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號X-100 ；
[0111]N-丁二酸-S-乙?；鶐€基乙二醇酯購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號A9043 ；
[0112]香豆素-6:購于美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品編號442631 ；
[0113]血管內(nèi)皮生長因子(VEGF165)購于美國PEPROTECH公司；編號為100-20，氨基酸序列為:
[0114]APMAEGGGQN HHEVVKFMDV YQRSYCHPIE TLVDIFQEYP
[0115]DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVP TEESNITMQI
[0116]MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRPKKDR ARQENPCGPC
[0117]SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQ LELNERTCRC
[0118]DKPRR
[0119]大豆磷脂購于上海太偉藥業(yè)有限公司；
[0120]聚乙烯醇(PVA)購于阿拉丁試劑(中國)有限公司，產(chǎn)品編號P105128 ；
[0121]RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；
[0122]高糖DMEM培養(yǎng)基:改良Eagle’ s細(xì)胞培養(yǎng)液，美國Hyclone公司；
[0123]胎牛血清購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；
[0124]TransDetect? Cell Counting Kit購于北京